[發明專利]杜氏藻耐高溫高光突變株及其誘變選育方法

有效

• 申請號: 200910135476.5
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101586080A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 吳洪;王媛媛;尹順吉;鄧平;蔡忠貞;袁普衛
• 申請（專利權）人: 新奧科技發展有限公司
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12N15/01;C12N13/00;C12P23/00;C12P17/04;C12P17/06;C12P7/64;C10G3/00
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司
• 代理人: 王 旭

技術領域

本發明涉及杜氏藻(Dunaliella?tertiolecta)UTEX?LB?999的耐高溫高光的突變株，以及所述突變株的誘變選育方法。具體而言，本發明涉及兩種杜氏藻耐高溫高光突變株，一種是耐受42℃高溫和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-2(CGMCC?No.2982)，另一種是耐受45℃高溫和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-4(CGMCC?No.2983)。

背景技術

杜氏藻(Dunaliella?tertiolecta)隸屬于綠藻門(Chlorophyta)、真綠藻綱(Chlorophyceae)、衣藻目(Chlamydomonadales)、杜氏藻科(Dunaliellaceae)，具有單細胞、無細胞壁、基因組小等特點。杜氏藻天然沒有細胞壁，是迄今為止發現的少數極端耐鹽的真核生物之一。杜氏藻富含β-胡蘿卜素、維生素C、維生素E，油脂含量高，并且杜氏藻具有罕見的耐受極端高鹽(可在飽和鹽水中生存)、高溫和高光強等極端生長環境的能力，生長條件相當粗放，因此成為人類主要的養殖藻類之一。據測算，杜氏藻室外全年養殖的平均生產率是平均20g干藻粉·m^-2·d^-1或0.25g胡蘿卜素·m^-2·d^-1。因此美、澳、以、日等國已興起大規模養殖杜氏藻提取胡蘿卜素的產業，同時還可收獲大量的蛋白質和甘油等副產物。

杜氏藻的最適生長溫度為25～30℃，當溫度超過35℃時，生長完全被抑制，藻細胞會逐漸死亡。而我國大部分地區夏季炎熱高溫，光照強度較高，常規的杜氏藻種難以耐受夏季高溫和強光照，因此，杜氏藻難以在夏季實現大規模養殖。如果能通過誘變獲得耐受高溫及高光的藻株，將擴大該藻株的應用范圍，對我國杜氏藻的養殖具有重要意義。

對于藻類的育種，目前普遍采用誘變育種法。誘變育種是指通過物理(射線照射等)和化學(誘變劑等)方法使藻類發生變異，從中選育出具有優良性狀的藻種，是微藻育種中使用最多也是最有效的一種方法。誘變育種既能誘發基因突變，又能促進遺傳基因重新組合，在短時間內獲得大量??優良突變體作為新品種直接利用或作為種質資源間接利用，具有選擇育種難以替代的優點。

常用的物理誘變輻射源有紫外線、倍頻Nd:YAG激光、He-Ne激光、半導體激光、⁶⁰Co-γ射線、超聲波等。紫外線是一種非電離輻射，可引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內和分子間的交聯、核酸與蛋白質的交聯，以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，從而導致基因突變。現有的研究已經通過紫外誘變的方法篩選獲得了很多有應用價值的藻株。

然而，目前用于藻類育種的一些現有的誘變育種技術存在一些缺點：現有技術篩選時間較短，通常只經過一次篩選，得到的突變藻株遺傳穩定性相對較差，容易出現回復突變；而且，現有技術一般只在室外進行高溫高光暴曬，很容易受到天氣因素的影響，實驗的重復性較差。

發明內容

為了杜氏藻類的大規模培養，擴大其應用的目的，本發明人在尋找高效的、可操作的和重復性好的誘變育種篩選方法的同時，篩選得到穩定的耐高溫高光的杜氏藻UTEX?LB?999誘變株系，完成了本發明。本發明所用的野生株是UTEX?LB?999，來源于UTEX?The?Culture?of?Alage(TheUniversity?of?Texas)。

因此，在第一方面中，本發明的一個目的在于針對常規的杜氏藻無法耐受高溫的缺陷以及常規選育方法的缺陷，提供一種采用紫外線誘變選育杜氏藻的耐受高溫高光突變株的方法。

所述方法包括下列步驟：

(1)將處于對數生長期的杜氏藻進行紫外誘變后，無光暗培養；

(2)取步驟(1)的誘變藻株培養液，在室外高溫高光條件下進行預備高溫高光處理，篩選存活的單個藻株；

(3)將步驟(2)的單個藻株進行高溫高光的初步篩選；和

(4)將步驟(3)篩選得到的單個藻株進行高溫高光復篩。

在本發明的一個實施方案中，所述誘變篩選方法步驟(1)的紫外誘變用2個20W紫外燈管作為紫外誘變的光源，距離藻液30cm，照射75s。但是，本領域技術人員應該理解，可以根據本領域公知常識適當選擇紫外誘變所用的紫外線波長/頻率、紫外光源距離藻液的距離、紫外照射的時間、紫外線照射量等參數。