[發(fā)明專利]川西獐牙菜香葉醇-10羥化酶基因SmG10H及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910129803.6
• 申請(qǐng)日: 2009-03-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101509005A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 向鳳寧;王俊峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N15/81;C12N15/82;C12N9/02;C12R1/84
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 王緒銀

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及川西獐牙菜藥效成分相關(guān)基因——香葉醇-10羥化酶基因SmG10H及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

高寒藏藥材川西獐牙菜(Swertia?mussotii?Franch)系龍膽科(Gentianaceae)、獐牙菜屬(Swertia)，為青藏高原特有種，俗稱“藏茵陳”。生長(zhǎng)在青藏高原海拔3600-3800米的山坡、灌叢草地、林緣、河灘，以通天河畔兩岸最為集中。其含有黃酮甙(flavonoidglycoside)、三萜香豆精微量生物堿、當(dāng)藥黃素、芒果甙、齊墩果酸、苦龍膽甙，還有八種山酮成份。作涼、糙、味苦，有清肝利膽、退諸熱之功能。用于黃疽性肝炎、病毒性肝炎以及血病、胃病、退燒、緩瀉、消化不良、急性骨髓炎、急性菌痢、結(jié)膜炎、咽喉炎及燙傷、膽囊炎、血虛頭暈、高血壓、月經(jīng)不調(diào)等，并有滋補(bǔ)作用。其有效成分主要為齊墩果酸，獐牙菜苦甙(Swertiamarin)等，野生資源極其匱乏。

獐牙菜苦苷味苦、性寒，歸肝、膽、腎經(jīng)，具有抗氧化、抗菌消炎、抗癌、抗突變以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，降血脂和膽固醇等一系列藥理作用。獐牙菜苦苷為環(huán)烯醚萜類化合物，從GPP(活性焦磷酸香葉酯)合成開(kāi)始，其代謝途徑框架基本清楚，但其完整的生物合成步驟尚未探明。香葉醇-10羥化酶(geraniol?10-hydroxylase，G10H)屬于P450單加氧酶，能夠催化香葉醇C10位的羥基化，使香葉醇再次酶的作用下生成10-羥基香葉醇。此類酶能夠催化環(huán)烯醚萜類化合物以及幾類單萜生物堿類的合成，已經(jīng)在不同生物物種中發(fā)現(xiàn)此酶，目前國(guó)內(nèi)外焦點(diǎn)主要集中在長(zhǎng)春花中的G10H上。在一些物種中環(huán)烯醚萜類化合物作為一種主要的中產(chǎn)物而積累，而在其他一些植物中則進(jìn)一步代謝形成不同種類的單萜類生物堿，例如喹啉，四氫異喹啉類生物堿。由于生物堿類化合物在川西獐牙菜相關(guān)藥效成分中并不占主流成分，因此我們認(rèn)為此酶在此可能為合成環(huán)烯醚萜類化合物的關(guān)鍵酶。

P450單加氧酶基因?yàn)橐粋€(gè)超基因家族，在植物的P450超家族中又分為127個(gè)亞家族，而亞家族成員間的氨基酸同源性一般情況下＞55％。但是，由于植物P450的底物多樣性和其酶功能的多樣性，使其亞家族成員間在酶活力和催化等功能上也不盡相同。本發(fā)明中的川西獐牙菜香葉醇-10羥化酶基因SmG10H，隸屬于植物P450中的76亞家族，與本家族其他成員間的核苷酸同源性最大為75.87％。該基因SmG10H所表達(dá)的蛋白在C端有著與其他亞家族成員不同的信號(hào)肽，可能導(dǎo)致其在細(xì)胞中的定位不同于其他亞家族成員所編碼的蛋白在細(xì)胞中的定位。另外，該基因SmG10H所表達(dá)蛋白的酶活力明顯高于已報(bào)道的植物P450的76亞家族其他成員的酶活力。綜上所述，本發(fā)明所報(bào)道的川西獐牙菜香葉醇-10羥化酶基因SmG10H非等同于其亞家族其他成員，具有一定的特異性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種獐牙菜苦苷相關(guān)基因——香葉醇-10羥化酶基因SmG10H及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：從川西獐牙菜中分離得到香葉醇-10羥化酶基因SmG10H，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明其功能，然后在真核系統(tǒng)中驗(yàn)證功能，最后將該基因轉(zhuǎn)到原植株川西獐牙菜中得到獐牙菜苦苷含量高的轉(zhuǎn)基因植株。

本發(fā)明提供的基因名稱為川西獐牙菜香葉醇-10羥化酶基因SmG10H，所述基因cDNA序列如序列表SEQ?ID?No.1所示。

本發(fā)明還提供了一種含上述的川西獐牙菜香葉醇-10羥化酶基因SmG10H的酵母表達(dá)載體pPICZA，其特征在于：所述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發(fā)明還提供了一種含上述的川西獐牙菜香葉醇-10羥化酶基因SmG10H的植物表達(dá)載體pROK?II，其特征在于：所述植物表達(dá)載體核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

本發(fā)明所述香葉醇-10羥化酶基因SmG10H在酵母或植株中表達(dá)香葉醇-10羥化酶和提高獐牙菜苦苷含量的應(yīng)用。其中：所述酵母是畢赤酵母；所述植株是川西獐牙菜。

首先在川西獐牙菜植株中克隆到了香葉醇-10羥化酶基因SmG10H；然后通過(guò)轉(zhuǎn)化的方法在大腸桿菌中得到大量克隆，接著通過(guò)雙酶切把此基因SmG10H連接到酵母表達(dá)載體pPICZA上，并在酵母上表達(dá)；接著篩選轉(zhuǎn)基因酵母，并提取川西獐牙菜香葉醇-10羥化酶基因SmG10H在酵母中表達(dá)的SmG10H蛋白提取液，加入底物香葉醇，使其催化成10-羥基香葉醇，通過(guò)LC/MS的方法檢測(cè)此催化反應(yīng)的生成物，從而驗(yàn)證異源表達(dá)的SmG10H的功能。