[發明專利]大腸桿菌耐熱性腸毒素STI突變體(Cys→Gly)分泌型表達載體

無效

• 申請號: 200910117233.9
• 申請日: 2009-02-24
• 公開（公告）號: CN101550424A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 王玉炯;李敏;趙輝;徐廣賢
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 寧夏專利服務中心
• 代理人: 葉學軍

技術領域：

本發明涉及微生物學、分子生物學與基因工程的相關實驗方法與技術，屬于微生物學、分子生物學與基因工程研究領域，特別是三種大腸桿菌耐熱性腸毒素ST_I突變體(Cys→Gly)的分泌型表達載體。

背景技術：

引起仔豬黃、白痢的致病菌為產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)，其致病因子主要為腸毒素和黏附素(adhesion)。腸毒素可分為耐熱性腸毒素(ST)和不耐熱性腸毒素(LT)。耐熱性腸毒素分為ST_I和ST_II，其中ST_I是最主要的直接致病因子。耐熱性腸毒素有毒且幾乎沒有免疫原性，當其與載體蛋白共價偶聯后，可表現出特異免疫原性。

ST_I在菌體內首先合成72個氨基酸的前體，ST_I前體由1～19個氨基酸前區、20～54個氨基酸后區和55～72個氨基酸成熟區組成。前區為ST_I類保守的領頭肽，在ST_ImRNA翻譯開始時便為信號肽酶所切割；后區在ST_I通過內膜進入細胞間質過程中有重要作用；要成為成熟ST_I，轉運后的后區ST_I必須經過加工和分子內正確二硫鍵的形成。

成熟的大腸桿菌ST_I為18～19個氨基酸的多肽，ST_I含有13個高度保守的氨基酸序列(5～17個氨基酸)，這段氨基酸小肽保留了ST_I的完全毒性，為毒性區，具有與天然毒素相似的受體蛋白結合能力。保守區內的6個Cys組成Cys5-Cys10、Cys6-Cys14和Cys9-Cys173個分子內二硫鍵，對ST_I的生物毒性至關重要。因該鍵屬于共價鍵，鍵能高，不易破壞，故分子結構高度穩定，因而耐熱(在100℃30min和121℃15min不失活)、耐酸堿(在pH2～10穩定)、耐多種有機溶劑和表面活性劑；抗各種蛋白酶水解，為肽類毒素中最特殊者。不被淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、鏈霉蛋白酶、糖化酶等失活。

如果將二硫鍵破壞，就可以使ST_I失去生物學毒性。因此，本研究采用PCR和基因定點突變技術，將ST_I基因成熟區第10、14、17位的半胱氨酸(Cys)密碼子TGT、TGT、TGC分別突變成編碼甘氨酸(Gly)殘基的密碼子GGT、GGT、GGC密碼子，成功獲得了大腸桿菌耐熱性腸毒素ST_I的3種突變體(Cys→Gly)--ST_I?C10/G、ST_I?C14/G、ST_I?C17/G及其分泌型表達載體pESG10、pESG14、pESG17與相應的重組菌株BL21(DE3)(pESG10)、BL21(DE3)(pESG14)、BL21(DE3)(pESG17)。從而為研究ST_I的結構與功能的關系、致病機理及開發新型仔豬腹瀉基因工程疫苗奠定了堅實的基礎。目前國內外尚沒有與本研究成果相關報道。

發明內容：

本發明的目的是提供三種大腸桿菌耐熱性腸毒素ST_I突變體(Cys→Gly)的分泌型表達載體，從而為研究ST_I的結構與功能的關系、致病機理及開發新型仔豬腹瀉基因工程疫苗奠定了堅實的基礎。本發明的目的按照下述方案實現：

一種大腸桿菌耐熱性腸毒素ST_I突變體(Cys→Gly)分泌型表達載體，是以產腸毒素性大腸桿菌強毒株C83922所提取質粒為模板，利用引物分別進行重組PCR，擴增得到三種ST_I突變體--ST_IC10/G、ST_IC14/G和ST_IC17/G，繼而將其克隆至pET-22b中，獲得了相應的分泌型表達載體pESG10、pESG14、pESG17與相應的重組菌株BL21(DE3)(pESG10)、BL21(DE3)(pESG14)、BL21(DE3)(pESG17)。分泌型表達載體中，突變體基因核苷酸序列分別為：

突變體基因ST_IC10/G核苷酸序列：

GCT?CAG?GAT?GCT?AAA?CCA?GTA?GAG?TCT?TCA?AAA?GAA?AAA?ATC?ACA?CTA?GAA?TCA?AAA?AAA???60