[發明專利]一種細菌性痢疾多價疫苗

無效

• 申請號: 200910116087.8
• 申請日: 2009-01-20
• 公開（公告）號: CN101569744A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 張鑫
• 申請（專利權）人: 張鑫
• 主分類號: A61K39/116
• 分類號: A61K39/116;A61P31/04
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司
• 代理人: 吳啟運

一、技術領域

本發明涉及疾病預防用的疫苗，確切地說一種細菌性痢疾多價疫苗。

二、背景技術

早在1898年，在東京北里研究所工作的Shiga就發現了志賀氏菌，100多年過去了，志賀氏菌引起的菌痢依然是全球范圍內最高發、最常見的傳染病。據世界衛生組織統計，全球每年菌痢患者達到1.647億，其中1.632億在發展中國家，造成110萬的死亡。細菌性痢疾是經糞口傳播的腸道傳染病，和地方的衛生條件息息相關，因而是發展中國家最常見疾病。我國細菌性痢疾也是一種多發病和常見病，每年的報告病例近100萬，是我國夏秋季發病率最高的傳染病。

志賀氏菌屬共分四群47個血清型，具體為痢疾志賀菌(Shigella?dysenteriae，13個血清型)、福氏志賀菌(Shigella?flexneri，15個血清型)、鮑氏志賀菌(Shigella?boydii，18個血清型)和宋內氏志賀菌(Shigella?sonnei，1個血清型)。菌型的分布在不同地區有所不同，在發達國家常以宋內氏志賀菌為主，在發展中國家以福氏志賀菌為主。痢疾志賀氏菌以I型為主，常引起中毒性痢疾，死亡率極高。我國地域遼闊，地區間的經濟發展不平衡，志賀氏菌的分布也有所不同，在經濟發達地區，宋內氏志賀菌比例在逐漸上升，但整體而言，我國志賀氏菌以福氏為主導，最常見的血清型為2a，其次可見1b、X變種、2b和4型等。痢疾志賀氏I型菌引起的病例不多，但由于發病急、病死率高，也應該引起足夠重視。

志賀氏菌屬發現雖逾百年，但目前還沒有特別有效的疫苗。我國批準有口服痢疾雙價疫苗，為全菌體活疫苗，含福氏志賀氏2a和宋內氏志賀氏菌兩個血清型的脂多糖抗原，但由于各方面的原因，到目前仍未大規模使用。從全球來看，針對細菌性痢疾的疫苗研發上世紀四、五十年代就已開展，但所有疫苗候選株或是安全性問題，或是效果不確定，都只開展到臨床研究階段。受b型流感嗜血桿菌多糖蛋白質偶聯疫苗的啟發，許多細菌性疫苗的研制都參照這種思路。志賀氏菌的O-特異性多糖是保護性抗原，以此多糖成分偶聯蛋白質載體制備細菌性痢疾疫苗從理論上將是可行的。國外用類似方法制備的福氏2a痢疾偶聯疫苗和宋內氏痢疾偶聯疫苗經人體試驗后，證明都能誘導產生高效價的特異性抗體應答。在以色列的臨床試驗證明，宋內氏痢疾偶聯疫苗能產生74％的對型保護。國內也有類似的研究報道，分別制備有痢疾志賀氏I型偶聯疫苗、福氏2a型偶聯疫苗、宋內氏偶聯疫苗，經動物試驗證明，都能誘導產生特異性的免疫應答。然而目前的化學偶聯疫苗均屬單價疫苗，沒有一種

覆蓋面廣的多價疫苗。

細菌的O-特異性多糖是來源于革蘭氏陰性細菌脂多糖的抗原成分。革蘭氏陰性細菌的脂多糖是一種毒性成分，也是細菌的保護性抗原，它的抗原決定簇位于脂多糖的O-特異性多糖側鏈部分。通過化學方法可將志賀氏菌的O-特異性多糖從菌體中分離出來，但O-特異性多糖分子量一般在1萬道爾頓左右，是半抗原，而且它的結構也是單元重復類型，屬于典型的T細胞非依賴型抗原，可以采用氨還原、氰化物活化或其他適宜的方法，將O-特異性多糖成分與載體蛋白質共價偶聯，使其轉化為T細胞依賴性抗原，制備出不同型的細菌性痢疾單價偶聯物。再者，由于志賀氏菌屬有多個血清型，常見的流行型也有數種，而O-特異性多糖成分是血清特異性的，血清群之間沒有交叉保護，血清型內部的交叉保護還有待于驗證，因而，開發盡量多的含蓋各種血清型細菌性痢疾的多價疫苗是可行的，尤其是優勢菌型。

三、發明內容

本發明針對現有細菌性痢疾疫苗多為減毒活疫苗、而少數化學偶聯疫苗均為單價偶聯疫苗的現狀，旨在提供一種安全性高、免疫原性好、覆蓋面廣的細菌性痢疾多價疫苗，所要解決的技術問題是首先提取血清型抗原O-特異性多糖，然后與載體蛋白質制備不同的單價偶聯物，最后要配成多價疫苗。

本發明采用液體培養基發酵罐培養志賀氏菌，經甲醛殺菌后，連續流離心收集菌體，-20℃以下保存備用。采用常規方法提取、純化脂多糖，如三氯醋酸法、酚水法和酚氯仿法等。純化好的脂多糖經弱酸水解，凝膠層析純化O-特異性多糖成分。

本發明還提供了一種全新的方法，用于制備O-特異性多糖成分。發酵罐培養的志賀氏菌，經甲醛殺菌后，中空纖維濃縮菌體，弱酸和/或表面活性劑處理菌體，離心收集上清，層析純化O-特異性多糖成分。

本發明制備的O-特異性多糖成分殘余核酸和殘余蛋白質含量都低于5％，最佳低于2％，更佳低于1％。內毒素含量低于100EU/μg多糖，最佳低于50EU/μg多糖，更佳低于10EU/μg多糖。制備的O-特異性多糖成分能與特異性血清形成免疫沉淀線。