[發明專利]一種檢測赭曲霉毒素A的無毒檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910115466.5
• 申請日: 2009-06-01
• 公開（公告）號: CN101566628A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 許楊;劉仁榮;何慶華;許夏
• 申請（專利權）人: 南昌博恒生物制品有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577;G01N33/52;G01N21/31
• 代理公司: 南昌新天下專利代理有限公司
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種檢測赭曲霉毒素A的無毒檢測試劑盒及其檢測方法，用于糧食，飼料及其食品中赭曲霉毒素A(簡稱OTA)含量的檢測。

背景技術

赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產生的次級代謝產物。它包含7種結構類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin?A，OTA)的毒性最強(大鼠經口LD₅₀為20mg/kg)。OTA易蓄積于組織中，其作用的主要靶器官是腎臟、肝臟，屬烈性的腎臟和肝臟毒素，實驗表明動物攝入被這種毒素污染的飼料后，會發生急性或慢性中毒癥。此外，據文獻報導OTA還具有致癌、致畸和致突變性。OTA的產毒菌株廣泛地存在于自然界中，在各種農作物、食品、飼料和人類及動物的組織和血液中都能檢測到OTA的污染。

目前OTA的檢測主要有薄層層析法(TLC)、熒光光度計法、高壓液相色譜法(HPLC)以及質譜聯合法等。HPLC等理化分析檢測方法可以精確地進行定性和定量分析，但是由于其設備昂貴、操作復雜和對樣品的純度有較高的要求，導致檢測成本高、周期長，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要，因而使用受到限制。免疫化學檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，對樣品的純度要求不高且操作簡單，特別適合于大批量樣本的檢測，被廣泛應用于OTA的快速檢測。

當前免疫學檢測方法是建立在以標記毒素或偶聯毒素為競爭抗原基礎上的有毒檢測體系，存在標品毒素昂貴，進口受限，對生產及操作人員的健康有害以及偶聯反應重復性差等缺陷，制約了其應用和推廣。若能用毒素的替代品作為競爭抗原，建立無毒檢測體系，將克服上述缺陷，使之更好地為人類服務。

近年來新興的噬菌體隨機肽庫展示技術為這一問題的解決提供了新思路。該技術是以一組隨機多肽編碼序列插入噬菌體展示載體，形成噬菌體展示文庫。每個噬菌體粒子只展示一種序列的外源肽鏈，不同噬菌體粒子展示不同序列的外源肽鏈。可采用親和選擇方法，高效挑選出能與配體分子相結合的噬菌體，并利用這些噬菌體再感染大腸桿菌，擴增。還可從重組噬菌體DNA中切出外源基因再克隆到其它宿主細胞中，經表達以獲得大量外源基因產物。利用噬菌體隨機肽庫確定蛋白質抗原的表位、篩選蛋白質抗原模擬表位的技術現在已經相當成熟，其在非蛋白質抗原模擬表位的應用已初現端倪。

發明內容

本發明的目的在于提供一種健康安全的用于檢測赭曲霉毒素A的試劑盒及其檢測方法，用于糧食，飼料及食品中赭曲霉毒素A含量的檢測。

本發明主要采用免疫分析方法來檢測OTA。主要包括：采用噬菌體展示庫技術淘選出能模擬出與抗赭曲霉毒素A單克隆抗體特異性結合的噬菌體粒子，以此粒子替代赭曲霉毒素A標準品，用競爭ELISA的方法來檢測OTA；運用了單克隆抗體技術制備出抗赭曲霉毒素A單克隆抗體。

本發明所述的試劑盒是由96或48孔包被板、緩沖液、赭曲霉毒素A標準替代物、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗M13酶標二抗、洗滌液、顯色液組成。

本發明所述的赭曲霉毒素A標準替代物是從噬菌體展示七肽庫(Ph.D.-7TM?PhageDisplay?Peptide?Library?Kit，購自New?England?Biolabs公司)中淘選得到的噬菌體粒子，具有能和抗赭曲霉毒素A單克隆抗體特異性結合的特征，其外殼蛋白含有特征性結合抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的氨基酸順序，氨基酸共有序列為：異亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-蛋氨酸-纈氨酸-X-X，X為任意氨基酸。

具體地說，由以下步驟組成：

(1)抗OTA單克隆抗體包被于酶標板，封閉液封閉后用鹽酸洗滌液洗滌，洗滌完畢后每孔加入噬菌體肽庫，室溫下結合后再用TBS洗滌，每孔加入洗脫液洗脫。

(2)中和洗脫液后留一部分作滴度測定，其余加到接種有E.coli?ER2738的LB培養液中進行擴增培養。

(3)測完滴度后，再進行數次親和篩選。每次加入的噬菌體量保持相同，包被的抗體量分別減少，洗滌液中Tween-20的濃度逐步增加，其余步驟與第一輪篩選相同。

(4)最后一輪篩選后的洗脫產物經滴度測定后，用滅菌牙簽挑選藍色噬菌斑，分別置于接種有處于對數生長前期的E.coli?ER2738的LB培養液中進行擴增培養、純化并測定滴度。

(5)ELISA鑒定特異性結合的陽性噬菌體克隆，用原始肽庫包板作為陽性對照，單抗包板加原始肽庫作陰性對照，單抗包板加PBST作空白對照。按測試樣品OD值與參考陰性OD值的比值(S/N)≥2.1判斷為陽性。