[發明專利]檢測結核桿菌耐藥基因膜芯片

無效

• 申請號: 200910114023.4
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101580879A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 何敏;韋世錄;何曉
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C12R1/32
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司
• 代理人: 黃永校

1.一種檢測結核桿菌耐多藥的基因膜芯片，特征在于針對常見結核桿菌rpoB、katG、embB、 inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突變位點，設計54個檢測探針，將探針點樣于 尼龍膜上構建成膜芯片，每一個被檢測樣本的DNA分4個反應管，每管加入三對不同的引 物，共12對引物是分別針對結核桿菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、 pncA基因特異設計的，其中每對引物中的下游引物5’端均帶有生物素標記，在同一PCR條 件下4個反應管同時經三重PCR，擴增出大量帶有生物素的結核桿菌相應的基因片段產物， 將擴增產物與膜芯片上的探針進行特異性雜交，雜交后帶有生物素的目標基因與探針牢牢的 結合在一塊，洗去未結合的擴增基因片段，再進行酶聯和顯色反應即可用肉眼判斷結果；

所述54個檢測探針中52個為結核桿菌檢測探針，2個為質控探針，

所述52個結核桿菌檢測探針中，包括14個檢測結核桿菌耐異煙肼的探針，分別命名為 kaN1、kaN2、ka315M、inN1、inN2、inN3、inN4、inN5、inN6、in-15M、in94M、ahN1、ahN2、 ah-15M，其探針5’→3’序列分別為：

TTTTTTTTTAAGACCCATGGCGCCGGC

TTTTTTTTTTGCGATCACCAGCGGCATC

TTTTTTTTTTGCGATCACCAMCGGCATC

TTTTTTTTTTCGCGGCGAGACGATAGGT

TTTTTTTTATCATCACCGACTCGTCGATC

TTTTTTTTTGATTCAGCGCATCACCGACC

TTTTTTTTTGGTGCTCACCGGGTTCGAC

TTTTTTTTGTGGTGCATTCGATTGGGTTC

TTTTTTTTGGATGGGCATCAACCCGTTCT

TTTTTTTTTTCGCGGCGAGATGATAGGT

TTTTTTTTGTGGTGCATGCGATTGGGTTC

TTGGTGTGATATATCACCTTTGCCTGACAG

TTTTTTTTACTTCACGGCACGATGGAATGT

TTTTTTTTACTTCATGGCACGATGGAATGT

所述52個結核桿菌檢測探針中，包括11個檢測結核桿菌耐利福平的探針，分別命名為 rpN1、rpN2、rpN3、rpN4、rpN5、rpN6、rp516M、rp526M1、rp526M2、rp531M1、rp531M2， 其探針5’→3’序列分別為：

TTTTTTTTGCCGCGATCAAGGAGTTCTTC

TTTTTTTTGGCACCAGCCAGCTGAGCCAA

TTTTTTTTCATGGACCAGAACAACCCGCTG

TTTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCCACAAG

TTTTTTTTTTTTTCCGACTGTCGGCGCTGG

TTTTTTTTTACGCGCGGGTCAACCCGTT

TTTTTTTTTCATGGKCCAGAACAACCCGCT

TTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCTACAAGC

TTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCGACAAG

TTTTTTTTTTTTGCCGACTGTTGGCGCTGG

TTTTTTTTCGCCGACTGTGGGCGCTG

所述52個結核桿菌檢測探針中，包括7個檢測結核桿菌耐鏈霉素的探針，分別命名為 rlN1、rlN2、rl43M、rl88M、rrN1、rrN2、rrN3，其探針5’→3’序列分別為：

TTTTTCCACCACTCCGAAGAAGCCGAACTC

TTTTTTTTGTGAAGGACCTGCCTGGTGTG

TTTTTCCACCACTCCGAGGAAGCCGAACTC

TTTTTTTTGTGAGGGACCTGCCTGGTGTG

TTTTTGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACG

TTTTTTTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG

TTTTTTCTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG

所述52個結核桿菌檢測探針中，包括6個檢測結核桿菌耐乙胺丁醇的探針，分別命名 為emN1，emN2，emN3，em306M1，em306M2，em306M3，其探針5’→3’序列分別為：

GGCATGGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT

TTTTTTTTGCCGGCTACATGTCCAACTAT

TTTTTTTTGAGGATCCCTTCGGCTGGTAT

GGCSTGGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT

GGCATWGCCCGAGTCGCCGTTTTTTTT

GGCATCGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT

所述52個結核桿菌檢測探針中，包括12個檢測結核桿菌耐吡嗪酰胺的探針，分別命 名為pnN1，pnN2，pnN3，pnN4，pnN5，pnN6，pnN7，pnN8，pnN9，pnN10，pn12M，pn85M， 其探針5’→3’序列分別為：

TTTTTTTTGAACGTATGGTGGACGTATGC

TTTTTTTTGACGTGCAGAACGACTTCTGC

TTTTTTTTTGGCAACCAAGGACTTCCACA

TTTTTTTTTCGACCCGGGTGACCACTTCT

TTTTTTTTGACTATTCCTCGTCGTGGCCA

TTTTTTTTGCATTGCGTCAGCGGTACTCC

TTTTTTTTGACTTCCATCCCAGTCTGGAC

TTTTTTTTGTGGTCGGTATTGCCACCGAT

TTTTTTTTCATTGTGTGCGCCAGACGGCC

TTTTTTTTAGGGTGCTGGTGGACCTGACA

TTTTTTTTGACGTGCAGAACGCCTTCTGC

TTTTTTTTGACTTCCATCCCAGTCGGGAC

所述52個結核桿菌檢測探針中，包括2個檢測結核桿菌耐喹諾酮類的探針，分別命 名為gyN1，gyN2，其探針5’→3’序列分別為TTTTTTTTCCCGCACGGCGACGCGTCGA， TTTTTTTCGATCTACGACAGCCTGGTGCGC；

所述2個質控探針分別為質控探針P和N，其探針5’→3’序列分別為 BIO’+CGCAGCGAGAGGTCAGTGG，TTTTTTTGTCCGAGCCGAGCATACGAG；

所述12對引物的5’→3’序列如下：

擴增katG基因上游引物P1序列為：TCGGCGGTCACACTTTCGGTA，下游引物P2序列為： BIO’+CGCAGCGAGAGGTCAGTGG；

擴增inhA基因片段1的上游引物P1序列為：CGGAAATCGCAGCCACGTTA，下游引物P2 序列為：BIO’+CAGGACTGAACGGGATACGAA；

擴增inhA基因片段2上游引物P1序列為：GCCACTGACACAACACAAGGA，下游引物P2序 列為：BIO’+ACGAATACGCCGAGATGTGGA；

擴增OxyR-ahpC基因上游引物P1序列為：GCTTGCGGCACTGCTGAAC，下游引物P2序列 為：BIO’+CACCACCCGCCACTTGCCT；

擴增rpoB基因上游引物P1序列為：GGAGCGGATGACCACCCAGGAC，下游引物P2 序列為：BIO’+CGTCGGCGGTCAGGTACAC；

擴增embB基因上游引物P1序列為：CGCACCTTCACCCTGACCGAC，下游引物P2序列為：BIO’ +ATCAGCGCCAGCAGGTTGTA；

擴增rpsL基因上游引物P1序列為：TCGTCGGGACAAGATCAGTAA，下游引物P2序列為： BIO’+CTTGACACCCTGCGTATCCA；

擴增rrs基因片段1的上游引物P1序列為：ACGAAGGTCCGGGTTCTCTC，下游引物P2序 列為：BIO’+GCATTCCACCGCTACACCA；

擴增rrs基因片段2上游引物P1序列為：AGGCGGGTCTCTGGGCAGTAA，下游引物P2序 列為：BIO’+TGCACACAGGCCACAAGGGAA；

擴增pncA基因片段1的上游引物P1序列為：GTCGCCCGAACGTATGGTG，下游引物P2序 列為：BIO’+CGAAGCCGCTGTACGCTCC；

擴增pncA基因片段2上游引物P1序列為：CGACGAGAACGGCACGCCACT，下游引物P2序 列為：BIO’+GCTGCAAACCAACTCGACGCT；

擴增gyrA基因上游引物P1序列為：ACCGCAGCCACGCCAAGTC，下游引物P2序列為： BIO’+CGGGCTTCGGTGTACCTCATC。