[發(fā)明專利]水牛胚胎干細(xì)胞的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910113970.1
• 申請(qǐng)日: 2009-04-10
• 公開（公告）號(hào): CN101531994A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石德順;黃奔;李童;崔奎青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/06
• 分類號(hào): C12N5/06
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司
• 代理人: 翁建華

1.一種水牛胚胎干細(xì)胞的制備方法，其特征是制備步驟為：

(1).水牛囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離：經(jīng)體外受精獲得的水牛囊胚和孵化囊胚，去掉透明帶及滋養(yǎng)層細(xì)胞，獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞；

(2).水牛胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)：分離得到的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)用經(jīng)絲裂霉素預(yù)處理的水牛胎兒成纖維細(xì)胞層作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，用杜貝柯氏最低成分培養(yǎng)液+20％胎牛血清+0.1mM非必需氨基酸+0.1mM?β—巰基乙醇+1mM丙酮酸鈉+20ng/ml小鼠重組白血病抑制因子、+40ng/ml人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和20ng/ml小鼠重組干細(xì)胞因子的培養(yǎng)液培養(yǎng)8～10天，獲得原代水牛胚胎干細(xì)胞克隆；

(3).水牛胚胎干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：獲得的水牛胚胎干細(xì)胞克隆，用0.25％胰蛋白酶的溶液消化5min，或用針頭直接機(jī)械分離后，接種于水牛胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，加入同(2)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)液每?jī)商旄鼡Q1次，直至形成干細(xì)胞克隆，再進(jìn)行消化傳代。