[發明專利]凝結芽孢桿菌的PCR快速檢測方法

有效

• 申請號: 200910113474.6
• 申請日: 2009-10-09
• 公開（公告）號: CN102041298A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 劉云國;丁生林;徐榕蔓;宋佳
• 申請（專利權）人: 中糧新疆屯河股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種凝結芽孢桿菌的PCR快速檢測方法。

背景技術

引起罐頭食品酸敗變質而又不胖聽(即產酸不產氣)的微生物在罐頭工業上稱為平酸菌。它是需氧芽孢桿菌科中的一群高溫型，具有嗜熱、耐熱的特點，其適宜生長溫度為45℃～60℃。凝結芽孢桿菌(Bacillus?Coagulans)是造成罐頭食品平蓋酸敗的一種重要微生物。凝結芽孢桿菌同時也是益生素，是近年來國內外迅速崛起的一類微生態制劑，它廣泛地應用于醫療、保健、食品、畜牧和水產等行業。因其具有調節腸道功能紊亂、維持腸道內菌群平衡和提高機體健康水平、能夠避免服用抗生素帶來的耐藥性和二重感染等問題的優點，一直受世人矚目。凝結芽孢桿菌除了具有上述優點外，同時還具有抗逆性強、耐高溫高壓、易貯存等獨特的生物特性，成為當今研究和應用的熱點，也是我國農業部2004年被批準使用的微生物級飼料添加劑品種之一。當前，凝結芽孢桿菌的檢測方法主要是傳統的增菌培養——純分離培養——生化鑒定，該方法的缺點是操作繁瑣、檢測時間長，而且生化鑒定的項目較多。隨著人們生活水平的提高，對食品安全的需求越來越高，同時，凝結芽孢桿菌微生態制劑的研制，生產規模的擴大，傳統檢測方法的低效率已經不能滿足當前批量化的檢測任務。因而，研究的凝結芽孢桿菌快速檢測方法很有必要。PCR方法具有檢測速度快、靈敏度高、成本低的優點，是當前細菌鑒定中一種快速有效的方法。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的不足，提供一種檢測速度快、成本低的快速檢測凝結芽孢桿菌的PCR方法。

本發明的技術解決方案是：一種快速檢測凝結芽孢桿菌的方法，其特征在于有如下步驟：

首先提取待測樣品增菌液的基因組DNA并稀釋備用。

然后進行PCR反應，每個PCR反應總體積為25μl，包括提取的基因組DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg²⁺1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP?0.1mmol/L；凝結芽孢桿菌特異性引物各10pmol；最后加ddH₂O至25μl；設置PCR儀的程序參數為：95℃變性5min；95℃30sec，56℃30s，72℃40sec，該反應進行35個循環；72℃延伸5min，4℃保存。其中凝結芽孢桿菌特異性引物為：

B.coag-F：5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA3’；

B.coag-R：5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’

最后進行電泳檢測，PCR產物與10×PCR上樣緩沖液混合，在加Gelred染色的1.5％瓊脂糖凝膠電泳中以DNA分子量標記對照進行檢測，如果在紫外燈下存在555bp的核酸片段，則說明有凝結芽孢桿菌。

本發明提供了一對擴增凝結芽孢桿菌的特異引物B.coag-F、B.coag-R，從而提供一種快速檢測凝結芽孢桿菌的方法，同現有技術相比具有如下優點：

1.檢測速度快，直接利用增菌液的基因組DNA進行檢測，省去了革蘭氏染色、分離純化和生化鑒定步驟，而分離純化和生化鑒定一般需要48～72h。

2.成本低，由于省略了革蘭氏染色、分離純化和生化鑒定步驟，節省了革蘭氏染色、分離純化培養基和生化試劑的費用，降低了檢測成本。

具體實施方式

首先無菌操作取1g待測樣品，加入盛有9ml酸性肉湯(酸性罐頭食品)或溴甲酚紫葡萄糖肉湯(低酸性罐頭食品及其它待測樣品)的滅菌容器內，55℃±1℃，需氧條件下培養48h。取培養的菌液加入離心管中，以12000rpm離心1min，棄上清液，利用菌體沉淀提取基因組DNA并稀釋備用。

然后進行PCR反應，每個PCR反應總體積為25μl，包括提取的基因組DNA，2μl；10×PCRBuffer，2.5μl；Mg²⁺1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP?0.1mmol/L；凝結芽孢桿菌特異性引物各10pmol；最后加ddH₂O至25μl；設置PCR儀的程序參數為：95℃變性5min；95℃30sec，56℃30s，72℃40sec，該反應進行35個循環；72℃延伸5min，4℃保存。其中凝結芽孢桿菌特異性引物為：

B.coag-F：5’-TACGGCATTGGCAAGTATCA3’；

B.coag-R：5’-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3’