[發明專利]一種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法

無效

• 申請號: 200910108233.2
• 申請日: 2009-06-17
• 公開（公告）號: CN101633959A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 李芳榮;龍海;彭德良;李一農
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司
• 代理人: 喻尚威

技術領域

本發明涉及包含酶或微生物的測定或檢驗方法，尤其是涉及一種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法。

背景技術

香蕉穿孔線蟲(Radopholus?similis?Thorne，1949)又名香蕉爛根病，是危害香蕉、花卉種植業及很多經濟作物的專性寄生線蟲，寄主范圍非常廣泛，危害造成的經濟損失極大，屬于主權國家禁止入境的植物檢疫危險性有害生物。為有效防止香蕉穿孔線蟲進境，通常采用的現有檢疫、檢測和鑒定方法是形態學方法、同工酶方法和聚合酶鏈反應(Polymerase?ChainReaction，簡稱PCR)方法。形態學方法要求相關人員要有豐富的經驗，并且由于香蕉穿孔線蟲存在種內變異，這種方法的檢疫、檢測和鑒定結果往往準確率不高，所需要的時間與操作人員的經驗相關聯；同工酶方法只能對雌蟲進行檢疫、檢測和鑒定，對幼蟲和雄蟲不能進行檢疫、檢測和鑒定，而且所需要的時間長達一天左右；基于PCR的分子診斷方法可以基本滿足香蕉穿孔線蟲的準確快速檢疫、檢測和鑒定要求，據有關文獻報導，目前采用一對普通PCR引物擴增的檢疫、檢測和鑒定方法，仍然需要2個多小時，而采用雙重PCR引物擴增的檢疫、檢測和鑒定方法，盡管只需要54分鐘，但是增加了一對引物，相應提高了檢疫、檢測和鑒定的成本。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是彌補上述現有技術的不足，提出一種改進的聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法。

本發明的的技術問題采用以下技術方案予以解決：

這種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法，依次有以下步驟：

1)合成引物，2)培養線蟲，3)提取核酸，4)擴增反應。

這種聚合酶鏈反應檢測香蕉穿孔線蟲的方法的特點是：

所述步驟1)合成引物是先設計一對由特異性正向引物Rs-F、特異性反向引物Rs-R組成的一對特異性引物，再按照特異性正向引物Rs-F、特異性反向引物Rs-R的序列合成特異性引物備用；

所述正向引物Rs-F的序列是：

5′-CAATACGATTCCGTCCTTTGGTGGGC-3′；

所述反向引物Rs-R的序列是：

5′-GGAAGTGACTCCAATGGCGCAATGTG-3′。

本發明的的技術問題采用以下進一步的技術方案予以解決：

所述步驟2)培養線蟲是在胡蘿卜片上培養香蕉穿孔線蟲群體。

所述步驟3)提取核酸是依次有以下子步驟：

3·1)將培養的線蟲群體或單條線蟲的幼蟲、成蟲或卵塊用滅菌水洗兩次，離心后將5μl線蟲轉移到1.5ml的滅菌Eppendorf管中，加入400μl包含200mM的pH?8.0的Tris-HCl、250mM?NaCl、25mM?EDTA和1％SDS的提取緩沖液，在-80℃放置30分鐘，用滅菌的碾棒將線蟲磨碎，在65℃孵育1.5小時；

3·2)加入200μl的pH?5.2的3M醋酸鈉，在冰上放置20分鐘，然后在4℃下用轉速13000rpm的離心機離心15分鐘，將上清液轉移至新的1.5ml的滅菌Eppendorf管中，加入600μl異丙醇混勻，在冰上放置30分鐘，再次在4℃下用轉速13000rpm的離心機離心15分鐘；

3·3)用濃度70％的乙醇清洗沉淀，加入20μl?TE緩沖液溶解沉淀，提取線蟲群體基因組DNA。

所述步驟4)擴增反應是對大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系進行擴增反應。

所述大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系包含5μl線蟲群體基因組DNA模板、0.2μM備用的特異性引物、0.2mM?dNTPs、1x?Ex?Taq?PCR緩沖液、2.0mM?MgCl₂、1.0U?Ex?Taq?DNA聚合酶和余量的雙蒸水，總共25μl。

所述大量香蕉穿孔線蟲的PCR擴增反應是依次有以下子步驟：

4·1)在94℃下預變性4min；

4·2)以94℃下反應30s、在56℃下反應30s、在72℃下反應45s為一個反應區間，重復進行35次；

4·3)在72℃下延伸反應10min，擴增反應結束后，取5μl擴增產物在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳，溴化乙啶染色后在凝膠成像儀下觀察拍照。

所述步驟4)擴增反應是對單條香蕉穿孔線蟲的PCR擴增體系進行擴增反應。