[發明專利]抑制人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因表達的siRNA重組慢病毒及應用

無效

• 申請號: 200910107003.4
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101875931A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 錢忠明;葛嘯虎;柯亞
• 申請（專利權）人: 香港理工大學深圳研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N7/01;A61K48/00;A61P25/28;A61P25/16;C12R1/93
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• 代理人: 羅瑤

技術領域

本發明涉及分子生物學、生物醫藥及基因工程技術領域，具體涉及利用慢病毒(Retrovirus)介導的RNA干擾技術，構建針對人膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)的慢病毒干擾體系(Retro-Heph)，及在制備鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。

背景技術

RNAi指的是當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默的現象。

2001年，Tuschl等將短的siRNA導入到哺乳動物細胞中并由此解決了在哺乳細胞內導入長的雙鏈RNA時引發的干擾素效應，由此拓展了RNAi在基因治療上應用前景。RNAi機制普遍存在于生物中，因此被認為是進化上相對保守的基因表達調控機制。一種假說為，RNAi機制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機制而存在的。目前發現，RNAi機制中的相關一些因子如內源性雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達進行調控，其范圍已經超越了PTGS(post?transcriptional?gene?silencing)，如RNAi機制同樣參與了轉錄水平上的基因表達調控過程中。由外界導入的長的雙鏈RNA首先被稱作Dicer并具有RNaseIII活性的RNA酶切割成21～23堿基對的小的雙鏈RNA，這種RNA被稱作small?interferingRNA(siRNA)，其特征是3′端相對于互補鏈突出兩個堿基。完成上述過程后，siRNA上結合RNAi蛋白因子，并形成稱為RISC(RNA-induced?silencingcomplex)的RNA-蛋白復合物。在RISC復合物中，siRNA依賴于ATP/或ATP非依賴性的轉換為單鏈，進而RISC被活化。活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導(guide?strand)，序列特異性地結合在標靶mRNA上并切斷標靶mRNA，引發靶mRNA的特異性分解。

RNAi在基因沉默方面的具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究的重要工具。大多數藥物屬于靶標基因(或疾病基因)的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，這功能丟失(LOF)的研究方法比傳統的功能獲得(GOF)方法更具優勢。因此，RNAi在今天的制藥產業中是藥物靶標確認的一個重要工具。同時，那些在靶標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以被進一步開發成為RNAi藥物。在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被用于臨床測試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化。

然而RNA干擾片段表達持續以及表達效率等重要問題阻礙了RNA干擾技術運用于臨床治療，要將RNA干擾用于基因治療，必須解決其靶向性、安全性以及表達持續性的問題。

shRNA即短發夾RNA(short?hairpin?RNA)。在RNAi感染過程中，產生dsRNA的一個有效方法就是在體內表達一個短發夾RNA，這種shRNA包含兩個短反向重復序列(其中一個與目的基因互補)，中間由一個loop序列分隔，組成發夾結構。在體內shRNA可以被加工成siRNA，從而降解目的基因抑制其表達。

膜鐵轉運蛋白輔助蛋白基因(HEPH)介紹

早在1962年，Grewal等就在放射誘導的突變小鼠中發現了一種新型的遺傳性小細胞低色素性貧血。由于其與X染色體相關，這種小鼠被稱為sla(伴性貧血)小鼠。Vulpe等(1999)通過基因譜研究，證實了sla小鼠X染色體上缺陷基因的存在。此基因被命名為Hephaestin(HP或Heph)，取自希臘神話中的金屬工藝之神Hephaestus。

Heph的分布

HP在體內的分布與鐵的吸收相關。免疫雜交技術和Westen印跡法、Northern印跡法顯示在成年小鼠體內HP蛋白及mRNA在整段小腸及結腸內高表達，在腎、肺、皮膚、肝、胎盤及其他組織中也有表達。原位雜交技術顯示在HP基因高表達的小腸區，絨毛處信號極強，而隱窩處幾乎沒有陽性信號。這與鐵在小腸絨毛處的吸收相一致。但HP在結腸高表達，而后者在鐵吸收過程中的作用甚微。在腸上皮細胞中，HP蛋白定位于基側膜，同時存在于細胞內的核周區；在培養的大鼠小腸細胞系IEC26中，HP蛋白主要分布于核周區，在細胞漿中也有少量存在。

Heph的功能