[發(fā)明專(zhuān)利]腸道病毒71型基因組的序列及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910106171.1
• 申請(qǐng)日: 2009-03-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101509003A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周伯平;楊桂林;劉威龍;陳心春;張明霞;劉映霞;徐六妹
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳市第三人民醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/41
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/41;A61K39/125;A61P31/14;G01N33/86;C07K16/10;C12R1/93
• 代理公司: 深圳市中知專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 呂曉蕾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腸道病毒，更具體的涉及腸道病毒71型基因組的序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

2008年全國(guó)大面積爆發(fā)了兒童手足口病。引起此次手足口病的罪魁禍?zhǔn)拙褪侨四c道病毒71型(EV71)。截止到2008年12月16日，NCBI公布的EV71相關(guān)序列為2145個(gè)，但其中并沒(méi)有EV71病毒全基因序列，因此無(wú)法得到全面資料以準(zhǔn)確判斷全球以及我國(guó)人腸道病毒71型的流行和遺傳變異情況，進(jìn)而無(wú)法了解目前全球手足口病的流行和遺傳衍化情況。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種EV71病毒的全基因序列。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明一方面提供了一種腸道病毒71型全基因組序列，其具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明另一方面提供了所述序列及與所述序列同源性達(dá)50-95％的序列在制備用于預(yù)防腸道病毒71型疫苗和血清學(xué)診斷ELISA試劑中的用途。

本發(fā)明另一方面提供了所述序列及與所述序列同源性達(dá)50-95％的序列在制備抗腸道病毒71型中和抗體中的用途。

本發(fā)明的有益效果在于該序列為進(jìn)一步獲得我國(guó)華南地區(qū)EV71型遺傳衍化特征提供了客觀依據(jù)，為進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)針對(duì)我國(guó)不同地區(qū)發(fā)病人群的血清學(xué)ELISA診斷試劑和疫苗提供了可靠的數(shù)據(jù)資料，為深入研究EV71的遺傳變異規(guī)律及手足口病的致病機(jī)制提供了寶貴資源。

附圖說(shuō)明

圖1是用megalign中的聚類(lèi)clusterW進(jìn)行一個(gè)聚類(lèi)后，獲得的比對(duì)結(jié)果。

圖2是EV71?VP1區(qū)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

病毒基因組核酸的提取和測(cè)序

1.采集標(biāo)本：采集深圳市東湖醫(yī)院收治的手足口病人的病毒分離標(biāo)本，包括糞便、皰疹液、腦脊液和咽拭子，用于采集咽拭子的無(wú)菌拭子要放在適當(dāng)?shù)谋４嬉褐校缇S持液或生理鹽水，以防干燥。

2.標(biāo)本處理：

2.1糞便標(biāo)本的處理

2.1.1每管中加入10ml?PBS、1g玻璃珠和1ml氯仿；

2.1.2在生物安全柜中從每份糞便標(biāo)本中取大約2g加入到標(biāo)記好的離心管中；

2.1.3將剩余的原始標(biāo)本留在原容器中并在-20℃凍存；

2.1.4擰緊離心管，機(jī)械震蕩器劇烈震蕩20分鐘；

2.1.5蓋好離心機(jī)的蓋子，密封離心桶，冷凍離心機(jī)在1500g離心20分鐘；

2.1.6在生物安全柜中將每一份標(biāo)本的上清液分別吸入2個(gè)有外螺旋蓋的凍存管中；

2.1.7一管糞便懸液凍存于-20℃作為備份，另一管存于4-8℃以備接種。

2.2皰疹液標(biāo)本的處理

皰疹液標(biāo)本直接用于病毒分離。

2.3腦脊液標(biāo)本的處理

腦脊液標(biāo)本直接用于病毒分離。

2.4咽拭子標(biāo)本的處理

在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?dòng)咽拭子(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞，然后在4℃條件下，10000rpm離心20分鐘，用上清接種到細(xì)胞上，如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過(guò)濾除菌。

3.分離病毒：

3.1顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康的，一個(gè)健康的單層細(xì)胞會(huì)在傳代后3天左右形成；

3.2倒掉生長(zhǎng)液(GM)，換上1-1.2ml的維持液(MM)；

3.3每一份標(biāo)本需要同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管(包括標(biāo)本的編號(hào)、日期、傳代數(shù))；

3.4每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對(duì)照；

3.5每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，34-35℃溫度培養(yǎng)；

3.6每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的出現(xiàn)(如細(xì)胞變圓，折光增強(qiáng)并脫離管壁等)；

3.7記錄接種管和對(duì)照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE(1+-4+)、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化(1+，<25％；2+，25％-50％；3+，50％-75％；4+，75％-100％)；

3.8如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實(shí)記錄，并觀察直到75％的細(xì)胞發(fā)生變化(3+CPE)，然后儲(chǔ)藏在-20℃以備二次傳代。同一病例的二次傳代的病毒分離物可以放到一起用于進(jìn)一步的鑒定；

3.9第1代培養(yǎng)見(jiàn)可疑細(xì)胞病變時(shí)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后-20℃或-70℃凍存；