[發明專利]乙酰肝素酶與熱休克蛋白的復合物及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200910104510.2
• 申請日: 2009-07-31
• 公開（公告）號: CN101670115A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 吳玉章;楊曌
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;A61K47/42;A61K38/47;A61K39/385;A61P35/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及一種蛋白復合物，特別涉及乙酰肝素酶與熱休克蛋白的復合物，還涉及該復合物的制備方法和應用。

背景技術

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的常見疾病。目前，惡性腫瘤的三大常規治療方法：手術治療、放射治療和化學治療已取得較大發展，但是，手術治療為局部治療手段，而惡性腫瘤呈浸潤性生長且易經過血管和/或淋巴管發生遠處轉移，中晚期惡性腫瘤患者單純依靠手術治療很難達到完全清除腫瘤細胞的目的；放射治療也是以局部治療為主，同樣存在手術治療的缺陷，且許多惡性腫瘤對放射治療不敏感；化學治療為全身治療手段，但存在耐藥和毒副作用大等缺點。近年來，免疫治療作為惡性腫瘤的第四種治療方法受到各國腫瘤學研究者的廣泛關注，腫瘤疫苗的開發成為研究熱點之一。

乙酰肝素酶(Heparanase，Hpa)是目前發現的唯一能降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的酶，能破壞細胞外基質(ECM)及基底膜(BM)，并參與腫瘤血管生成，與腫瘤的侵襲轉移密切相關。其主要機制在于：(1)ECM和BM是限制腫瘤轉移的屏障，乙酰肝素酶通過降解ECM和BM中的HSPG，破壞ECM和BM的完整性，從而促進腫瘤細胞的浸潤及轉移；(2)Hpa通過直接和間接兩種方式發揮促血管生成作用：直接作用于內皮細胞以出芽方式促進血管生成；同時，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)作為最強的血管生成誘導因子，平時以無活性形式與硫酸乙酰肝素(HS)結合貯存于ECM中，當Hpa降解HSPG時，有高度活性的HS-bFGF復合物被釋放出來，間接誘發血管生成；此外，被固化在HSPG上無活性的血管內皮生成因子(VEGF)在Hpa降解HSPG的過程中也得到釋放并被激活，與bFGF共同誘導腫瘤血管生成。越來越多的研究表明，Hpa在正常組織中不表達，但在幾乎所有中晚期惡性腫瘤中高表達，與腫瘤患者的不良預后密切相關。因此，Hpa逐漸成為引人注目的抗腫瘤治療新靶點。但是，單獨以Hpa作為腫瘤疫苗時，需要與免疫佐劑聯合應用，而佐劑為外源性物質且誘導的天然免疫應答特異性低，可能引起一系列的毒副反應；此外，由于主要組織相容性復合體(MHC)的限制，其使用對象也相當有限。

熱休克蛋白(HSP)是一類在生物進化中高度保守，廣泛存在于原核和真核生物中的蛋白質，具有“分子伴侶”作用，參與胞內蛋白質的折疊、裝配和轉運等過程。HSP按分子量大小分為以下幾個家族：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小HSP家族。每個家族又由多個成員組成，如HSP70家族成員有HSP70、熱休克同源蛋白(HSC)70、糖調蛋白(GRP)78和GRP75等，HSP90家族成員有HSP90和糖蛋白(GP)96等。許多研究結果證實，從腫瘤組織中提取的HSP可以誘導機體產生針對該腫瘤的免疫應答，達到治療腫瘤的目的。進一步研究表明，從腫瘤組織中提取的HSP實際為結合了抗原多肽的HSP多肽復合物，其可通過以下幾方面誘導機體的抗腫瘤免疫：(1)HSP多肽復合物作為完整抗原，被抗原遞呈細胞攝取、加工后，與MHC結合并遞呈到細胞表面，從而活化T細胞，包括CD4+和CD8+T細胞，特別是細胞毒性T細胞，產生抗腫瘤的特異性細胞免疫；HSP在此處起到載體或佐劑的作用，誘導免疫應答的是其結合的抗原多肽；(2)HSP本身具有活化巨噬細胞和樹突狀細胞(抗原遞呈細胞)的作用，從而增加共刺激因子和MHC的表達，加強機體的抗腫瘤免疫；(3)自然殺傷細胞和γδT細胞是體內重要的抗腫瘤免疫細胞，對腫瘤細胞的殺傷效應不受MHC的限制，HSP可直接作為抗原遞呈分子，將抗原多肽遞呈至細胞表面，從而活化自然殺傷細胞和γδT細胞，產生抗腫瘤的非特異性免疫。以HSP多肽復合物為基礎的腫瘤疫苗具有以下獨特優勢：(1)由于HSP結構上的高度保守，不具有多態性，可在同種內相互使用，不受MHC的限制；(2)HSP具有免疫佐劑的作用，省略了常規蛋白免疫需要免疫佐劑的麻煩。近年來研究發現，HSP110是HSP70家族的成員，是一種對較大的抗原多肽也具有伴侶作用的高分子量HSP，具有強大的免疫佐劑效應，因此，其在腫瘤免疫治療中的應用頗受矚目。目前，以HSP多肽復合物為基礎的腫瘤疫苗多采用HSP70、HSP90和GP96進行構建，尚未見采用HSP110構建腫瘤疫苗的研究報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種Hpa與HSP的復合物。

為達到此目的，本發明提供了一種Hpa與HSP的復合物，由Hpa與HSP110以非共價鍵結合而成，所述Hpa具有SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列，HSP110具有SEQ?ID?No.8所示的氨基酸序列。