[發(fā)明專利]一種非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910103883.8
• 申請(qǐng)日: 2009-05-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102174632A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏仕文;方國(guó)蘭;徐紅梅;葛超;郭麗娟;李陽(yáng);楊智慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶郵電大學(xué);重慶凱樂(lè)爾生物催化技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12P41/00
• 分類號(hào): C12P41/00;C12P13/04
• 代理公司: 重慶市恒信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及非天然L-氨基酸的生物催化去消旋化制備方法，屬于生物催化不對(duì)稱氧化制備手性醫(yī)藥中間體技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

非天然L-氨基酸是自然界中不存在的非蛋白源氨基酸。非天然L-氨基酸及其衍生物如保護(hù)非天然L-氨基酸、非天然L-氨基醇等是手性藥物的關(guān)鍵中間體，在醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。例如，L-2-氨基丁酸是抗癲癇藥物左乙拉西坦中間體，L-2-氨基戊酸是抗高血壓藥物培哚普利中間體，L-2-氨基己二酸是谷氨酰胺合成酶抑制劑中間體，L-叔亮氨酸是抗病毒、抗腫瘤和抗炎藥物中間體，L-環(huán)己基甘氨酸是環(huán)氧合酶(COX-2)抑制劑JTE-522中間體，L-鄰氯苯甘氨酸是抗血栓藥物氯吡格雷中間體，L-對(duì)氟苯甘氨酸是抗癌藥物中間體，L-2-氨基-4-苯基丁酸是普利類抗高血壓藥物中間體，L-哌啶-2-羧酸是局麻藥羅哌卡因、抗精神病藥物硫利噠嗪中間體，L-哌嗪-2-羧酸是HIV蛋白酶抑制劑中間體。

非天然L-氨基酸不能像天然L-氨基酸一樣采用發(fā)酵法生產(chǎn)。盡管非天然L-氨基酸可以采用化學(xué)法制備，但化學(xué)不對(duì)稱合成采用價(jià)格昂貴的手性源、手性助劑或手性催化劑，化學(xué)拆分工藝路線復(fù)雜、環(huán)境污染大。無(wú)論是化學(xué)不對(duì)稱合成或是化學(xué)拆分，都存在收率低、光學(xué)純度不高、生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。生物催化法具有立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等特征，是制備對(duì)映純非天然L-氨基酸極為有用的方法。目前大量具有商業(yè)價(jià)值的非天然L-氨基酸都是用生物催化法制備的(Breuer?M，Ditrich?K，Habicher?T，HauerB.Angew?Chem?Int?Ed，2004，43，788)。生物催化法包括酶拆分法和酶催化不對(duì)稱合成法。外消旋體的酶催化動(dòng)力學(xué)拆分是制備非天然L-氨基酸的一個(gè)最成功的策略，但涉及消旋氨基酸的衍生以及游離氨基酸和衍生氨基酸的分離，工藝復(fù)雜，非天然L-氨基酸的理論收率僅為50％。因此，為了避免D-對(duì)映體的浪費(fèi)，有必要開(kāi)發(fā)收率＞50％的非天然L-氨基酸酶催化或化學(xué)酶催化合成方法。這可以通過(guò)三個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：前手性底物的酶催化不對(duì)稱合成，酶催化動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分，酶催化去消旋化。酶催化去消旋化可以采用兩種策略：采用具有互補(bǔ)對(duì)映選擇性的雙酶或多酶系統(tǒng)如氨基酸脫氫酶/轉(zhuǎn)氨酶；對(duì)映選擇性酶催化氧化反應(yīng)和非選擇性、非酶還原反應(yīng)組合。

D-氨基酸氧化酶在分子氧存在下，立體選擇性催化D-氨基酸氧化脫氫為相應(yīng)的亞氨基酸，亞氨基酸經(jīng)歷非酶水解為酮酸。D-氨基酸氧化酶已成功用于從頭孢菌素C工業(yè)合成7-氨基頭孢烷酸(7-ACA，半合成抗生素的關(guān)鍵母核)、去除L-氨基酸中的少量D-對(duì)映體和從DL-氨基酸制備非天然L-氨基酸。為了獲得收率＞50％的非天然L-氨基酸，對(duì)D-氨基酸氧化酶催化DL-氨基酸氧化和化學(xué)還原劑組合體系進(jìn)行了廣泛的研究。組合D-氨基酸氧化酶和NaBH₄用于DL-哌啶-2-羧酸的去消旋化，L-對(duì)映體的產(chǎn)率和光學(xué)純度均＞98％(Soda?K，Oikawa?T，Yokoigawa?K.J?Mol?Catal?B：Enzymatic?2001，11，149.)。以NaCNBH₃替代NaBH₄為還原劑和豬腎D-氨基酸氧化酶為生物催化劑，實(shí)現(xiàn)了哌嗪-2-羧酸的去消旋化，收率和ee分別為86％和＞99％。以NaBH₄作還原劑，DL-苯甘氨酸、2-氨基丁酸、環(huán)戊基甘氨酸等非環(huán)和環(huán)狀氨基酸去消旋化產(chǎn)生的非天然L-氨基酸收率75-90％，ee＞99％(Beard?TM，Turner?NJ.Chem?Commun，2002，246.)。在這些方法中采用NaBH₄或NaCNBH₃與D-氨基酸氧化酶組合將DL-氨基酸去消旋化轉(zhuǎn)化為非天然L-氨基酸有3個(gè)缺點(diǎn)：1)NaBH₄對(duì)水敏感，在D-氨基酸氧化酶表現(xiàn)最大活性和穩(wěn)定性的pH(酸性或中性)條件下易分解。為使還原有效，必須多次緩慢加入且當(dāng)量很大(500個(gè)當(dāng)量以上)。雖然NaCNBH₃比NaBH₄的水穩(wěn)定性好，但反應(yīng)性較低，從而導(dǎo)致產(chǎn)生的非天然L-氨基酸收率低；2)大量NaBH₄的加入致使操作pH接近10。在如此高pH下，D-氨基酸氧化酶容易通過(guò)不可逆變性快速失活，增加制備成本，難于規(guī)模化；3)必須采用價(jià)格高昂的D-氨基酸氧化酶作生物催化劑。因此有必要提出基于D-氨基酸氧化酶的適合非天然L-氨基酸規(guī)模化制備的生物催化去消旋化方法。