[發明專利]來自苛求芽孢桿菌的兩種尿酸酶和其突變體及它們的聚乙二醇修飾與應用

有效

• 申請號: 200910103741.1
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101875922A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 廖飛;趙運勝;楊曉蘭;李想;張純;馮娟;卜友泉;謝燕玲
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N11/08;C12Q1/62;C12Q1/26;G01N21/33;C12Q1/28;A61K38/44;A61K47/48;A61P19/06;A61P35/00;A61P35/02;C12R1/07
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1.兩種尿酸酶蛋白，所述這兩種尿酸酶蛋白中天然酶蛋白都是來自苛求芽孢桿菌的同四聚體單純蛋白質，都可用分子氧催化尿酸氧化并生成過氧化氫。

2.按照權利要求1所述的兩種尿酸酶，其包括從苛求芽孢桿菌胞內和胞外蛋白中純化的且具有序列1和序列3的氨基酸序列的可溶天然尿酸酶，及這兩種天然尿酸酶蛋白N端前七個氨基酸殘基中有部分殘基被替換或缺失的突變體、或前述兩種天然尿酸酶蛋白C端缺失不多余14個殘基的突變體、或前述兩種天然尿酸酶蛋白中N端前七個氨基酸殘基被替換或缺失且同時C端缺失不多于14個氨基酸殘基的突變體、或在兩種天然尿酸酶的N端前七個氨基酸殘基中存在替換且N端朝前延伸了不多于十個中性側鏈氨基酸殘基的突變體、或在兩種天然尿酸酶的N端前七個氨基酸殘基中存在替換且N端朝前延伸了不多于十個中性側鏈氨基酸殘基同時C端缺失不多于十四個氨基酸殘基的突變體，及這些尿酸酶和其突變體的聚乙二醇單甲醚修飾產物。

3.按照權利要求2所述的兩種尿酸酶，可從苛求芽孢桿菌胞內或分泌到胞外的可溶蛋白中純化，對應天然尿酸酶蛋白同四聚體每個亞基含有332個氨基酸，其氨基酸序列分別為序列表中的序列1和序列3；對應的尿酸酶蛋白突變體可通過基因重組后原核表達獲得，在重組表達時可在C端或N端再添加五個到七個連續組氨酸殘基作為親和層析純化的標簽，對應尿酸酶蛋白同四聚體的每個亞基含305到360個氨基酸殘基；這兩種尿酸酶及其突變體的等電點都在4.0到6.5之間。

4.按照權利要求2和權利要求3所述的兩種尿酸酶，可通過基因重組表達獲得對應尿酸酶蛋白突變體，且這些尿酸酶蛋白突變體中部分位置的中性側鏈氨基酸殘基可突變成半胱氨酸殘基以便用溴乙酰或碘乙酰活化的聚乙二醇單甲醚進行修飾，這些可突變成半胱氨酸殘基的中性氨基酸殘基包括序列1中16、52、55、81、101、131、156、163、174、187、233、237、254、263所對應絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等殘基中的任一個或任意多個的組合，及序列3中對應位置的殘基。

5.按照權利要求2和權利要求3和權利要求4所述兩種尿酸酶蛋白具有以下特征：

A、來自苛求芽孢桿菌胞內可溶蛋白的天然尿酸酶氨基酸排序如序列1；其N端前七個氨基酸殘基可被替換或截短仍保留尿酸酶活性，但N端的前七個氨基酸殘基被截短后突變體尿酸酶的活性會下降；N端可朝前延伸不多于十個中性側鏈氨基酸殘基并可再包含用于親和純化的連續組氨酸殘基標簽序列；序列1中的第144位氨基酸殘基可以是丙氨酸且仍保留活性。

B、來自苛求芽孢桿菌分泌到胞外的可溶尿酸酶氨基酸排序如序列3，其N端對應的前七個氨基酸殘基與序列1的N端殘基不同而其余氨基酸序列全部相同，可突變成半胱氨酸的中性側鏈氨基酸殘基位置和組合方式也與胞內尿酸酶相同；序列3中的第144位氨基酸殘基可以是丙氨酸且仍保留活性。

C、來自苛求芽孢桿菌胞內和分泌到胞外的兩種天然尿酸酶催化能力相當；兩種天然尿酸酶對黃嘌呤的敏感性相當且都比常見真核尿酸酶敏感性低得多；兩種天然尿酸酶突變體對底物尿酸的親和力較低，對尿酸的米氏常數在0.10mmol/L以上；兩種天然尿酸酶對水透析都會解聚成二聚體而失活，但用高離子強度的緩沖液處理時對水透析失活的這兩種天然尿酸酶的大部分活性都可恢復。

D、這兩種天然尿酸酶和其突變體都可在大腸桿菌中重組表達，并可用N-羥基琥珀酰亞胺活化的平均分子量不低于2000Dalton的聚乙二醇單甲醚在堿性條件下修飾其氨基，修飾后可保留45％以上的催化活性；也可用碘乙酰或溴乙酰活化的聚乙二醇單甲醚修飾突變所得半胱氨酸殘基，并保留更高的比活性。

E、這兩種天然尿酸酶及其突變體經平均分子量不低于2000Dalton的聚乙二醇單甲醚修飾后，在哺乳動物血漿中可有效降低血漿尿酸，且在動物體內10小時內活性可保留30％以上；但未經聚乙二醇單甲醚的兩種天然尿酸酶或它們的突變體在大鼠體內2小時內活性就降到10％以下。

6.這兩種天然尿酸酶及其各種突變體可直接用于終點平衡法測定反應前和反應完成后293nm紫外吸收之差確定反應體系的底物尿酸含量，或與過氧化物酶聯合用于間接終點平衡法測定對應于過氧化氫的有色產物量間接確定反應體系的尿酸含量；也可用于動力學方法預測尿酸酶反應體系本底快速測定反應體系的底物尿酸含量，這種方法的數據處理可采用中國發明專利ZL03135649.4所要求的專屬方法。

7.這兩種天然尿酸酶及其突變體經聚乙二醇單甲醚修飾后都可用于預防和治療人體的高尿酸血癥相關疾病，包括痛風及淋巴瘤、白血病等化療時導致的腫瘤溶解綜合癥；這兩種天然尿酸酶及其突變體用于降低人體血漿尿酸的應用方式包括靜脈注射到血液和在血液體外透析時使用；經靜脈注射到血漿中發揮作用時這些天然尿酸酶及其突變體經聚乙二醇單甲醚修飾封閉抗原決定簇和延長其體內半衰期；這兩種尿酸酶及其突變體也可在血液透析治療時在體外使用降低血漿尿酸水平，對應這種應用方式所用這兩種天然尿酸酶及其突變體可不經過聚乙二醇單甲醚修飾，且這種使用方式也不限于本發明所述的各種尿酸酶。