[發明專利]家蠶滯育品種的轉基因方法

無效

• 申請號: 200910103397.6
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101503704A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 馬三垣;夏慶友;徐漢福;趙愛春;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司
• 代理人: 周韶紅

1.一種家蠶滯育品種的轉基因方法，其特征在于依次通過下列步驟實現：

(1)將家蠶滯育品種的蠶卵通過人工孵化處理后，置于15℃恒溫、相對濕度75％、黑暗的環境中催青至孵化；

(2)逐天收集孵化的蟻蠶，置于23℃恒溫、相對濕度85％、黑暗的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至三眠結束；

(3)將四齡起蠶轉移至27℃恒溫、相對濕度75％、光照的環境中用桑葉或者人工飼料飼養至上蔟；

(4)將上蔟后的家蠶轉移至25℃恒溫、相對濕度75％、光照的環境中，待其化蛹完畢后削開繭殼，將裸露的蛹體轉移至26℃恒溫、相對濕度75％、光照的環境中進行種繭保護；

(5)待羽化后收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25℃、弱光的條件下交配4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每間隔0.5h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25℃的環境中保護；

(6)以收集蠶卵時間開始記時，于收集后2h-4h用顯微注射儀將10-15nL、總濃度400ng/uL的轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入已經消毒的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼上注射留下的小孔；

(7)將注射完成的蠶卵在35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min后，置于25℃、相對濕度85％以上的濕度條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代(G0)的蠶蛾進行自交或回交，獲得滯育性的G1代蠶卵，G1代蠶卵經即時浸酸處理后于胚胎發育第六天在熒光顯微鏡下掃描獲得轉基因個體；最后將獲得的轉基因個體正常飼養、繼代，即完成家蠶滯育品種的轉基因蠶的制作；

上述步驟中，h表示小時，min表示分鐘。