[發明專利]一種無假陽性T載體及制備方法

無效

• 申請號: 200910103334.0
• 申請日: 2009-03-06
• 公開（公告）號: CN101503698A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 馬躍
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/64
• 代理公司: 重慶華科專利事務所
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明內容屬于生物技術領域，具體涉及一種T載體及制備。

背景技術

1、質粒載體

分子克隆技術是基因工程技術的基礎。分子克隆技術用于將一段目的基因(DNA片段) 插入一個DNA載體中以長期保存和大量制備該目的基因供進行后續研究。最常用的分子克 隆載體是質粒載體：一個能在細菌細胞中自主復制、傳代的閉合環狀雙鏈DNA分子。一個用 于分子克隆的質粒載體至少要包含如下3個功能單元：質粒自主復制必須的基因元件，1-2 個抗生素抗性基因，供插入目的DNA片段用的酶切位點。現代正篩選質粒載體還包括一個 用于正篩選陽性克隆的篩選標記基因(如利用α互補原理進行藍白斑篩選的β半乳糖苷酶α 片段基因)。

2、T-A克隆技術和T載體

PCR技術產生以后已經成為最常用的獲取目的基因的技術，最初克隆PCR片段的方法是 通過PCR引物在擴增的DNA片段兩端引入與克隆載體匹配的酶切位點，然后酶切PCR產物， 通過連接酶將其插入同樣酶切的克隆載體中。后來又發展出能更快捷克隆PCR片段的T-A克 隆技術。

T-A克隆技術的原理是：PCR反應中普通Taq酶能在擴增的DNA片段的3’端添加一個突 出的dA，因此如果線性化的載體的3’端具有一個突出的dT，則與PCR片段形成互補的粘性 末端，二者就能夠高效連接從而獲得包含目的PCR片段的重組質粒，這一技術即為T-A克隆 技術。目前常用的T載體制備方法有兩種：

(1)平末端加T法：在普通克隆載體(即前T載體，如pUC18)的陽性克隆正篩選標記基 因(如pUC18中的LacZ基因)編碼區內部通過平末端內切酶(如pUC18中的Sma?I)將前 T載體酶切線性化，再利用Taq酶的末端轉移酶活性在只有dTTP存在的條件下在線性化后的 平末端載體分子的3’端加上1個dT，制備成T載體。

(2)雙位點酶切直接制備法：在陽性篩選標記基因內引入兩個串聯的、切開后能在線性化 載體的兩個3’端突出一個dT的同一內切酶位點(如Xcm?I)即構成前T載體，這種前T載 體只需用相應內切酶切開前T載體，純化回收載體片段即可制備T載體。

T載體是T-A克隆技術的核心，現在有很多試劑生產商制造、銷售商品化的T載體。與 需要酶切后再連接的傳統分子克隆技術相比，T-A克隆技術極大地簡化了克隆目的基因的過 程，而且方便目的基因的序列測定和通過酶切進行亞克隆(以便進行目的基因的表達)，現在 已經成為分子克隆的常規技術。

3、現有T載體的技術機制缺陷

T-A克隆技術提供了將PCR片段高效連接插入載體的捷徑，但是現有T載體由于設計上 的技術機制缺陷，其應用于T-A克隆時在陽性克隆篩選環節仍然存在較大的問題，即假陽性 問題，并因此給使用者的克隆實驗帶來很大的困難。

現有T載體大多是利用α互補原理的藍白斑篩選技術來篩選陽性克隆的：載體上有β半 乳糖苷酶的α片段(Lac?Z)表達盒，PCR片段的插入位點就設計在α片段的編碼區內部(靠 近N端)。因此當目的片段插入T載體后，α片段的讀碼框被打斷，因而不能正確表達(插入 失活)，含有重組載體的陽性轉化子在含有誘導劑IPTG和顯色底物X-gal的篩選培養基上生 長的菌落為白色；反之，含非重組載體(即前T載體)的陰性轉化子會由于α片段的表達在上 述篩選培養基上長成藍色菌落。因此，利用這一正篩選技術，只需要將轉化產物在篩選培養 基上培養就可通過菌落顏色篩選出陽性克隆。

然而現有T載體在實際應用時長出的白色菌落中有一部分并不含有插入片段(即所謂假 陽性克隆)。那么這些假陽性克隆是如何產生的呢？

1)平末端加T制備的T載體

這種T載體是在前T載體的陽性克隆篩選標記基因內的平末端酶切位點將其酶切線性化 后在兩個3’端額外添加了一個dT，因此，如果在T-A克隆中線性化T載體分子自連(又稱 誤連，mis-ligation，即非互補粘性末端的連接)，其轉化入宿主細胞后這個不互補的dT—dT 堿基對會經宿主細胞修復為互補的dT—dA堿基對，于是是α片段的編碼區內在此處多出了 1個bp，這毫無疑問將使其后面的讀碼框(ORF)完全改變(稱為移碼，frame?shift)，其后 果是α片段不能正確表達，轉化入宿主細胞后不能完成α互補，與有PCR片段插入的陽性克 隆一樣呈現為白色菌落，成為假陽性克隆。

2)雙位點酶切直接制備的T載體：