[發明專利]枯草芽孢桿菌中性植酸酶phyC基因

無效

• 申請號: 200910103029.1
• 申請日: 2009-01-08
• 公開（公告）號: CN101492688A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 余茂德;李鎮剛;王茜齡;金筱耘;黎其友;吳存容
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/16
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是一種來自微生物的具有酶解植酸、植酸鹽及其絡合物、釋放出磷等礦質營養元素活性的中性植酸酶基因phyC。?

背景技術

植酸(phytic?acid)又名肌醇六磷酸(myo～inositol?hexakisphosphate)，對植物體本身來說，可作貯藏性磷，在種子發芽時，逐漸被水解利用。但其絕大部分以復鹽的形式存在，是一種抗營養因子。它和胰蛋白酶原抑制劑、凝血素、皂角素、單寧、草酸、硫代葡萄糖苷、棉酚、抗脂溶性維生素、抗B族維生素等多種抗營養物質一樣，在飼料中被畜禽采食后，影響畜禽對礦物營養元素和蛋白質等的消化吸收。并且非反芻動物因缺少水解植酸、植酸鹽及其絡合物的消化酶，在生理上對植酸鹽中的磷是不可利用的。?

植酸酶(phytase)，是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或鹽)的一類酶的總稱，能水解植酸最終釋放出無機磷。因此在動物飼料中添加植酸酶可以改良磷酸鹽的生物利用度，消除植酸的抗營養作用，減少非反芻動物未能吸收植酸、植酸鹽及其絡合物中的磷向環境中的排泄，減少環境富磷營養化的污染；并可減少動物飼料中無機磷的添加。而且，在食品中應用植酸酶可以改善人對鐵、鋅的吸收利用，對提高食品的營養也具有意義。?

目前從微生物中獲得植酸酶的報道有以下三種：(1)主要來源于黑曲霉的酸性植酸酶(phyA)，它具有較高的酶活性，其酶促反應的pH值有效范圍在4.5～6.0之間，適用于胃pH呈酸性的單胃動物及少數魚類，不適用于消化道呈中性的鯉科魚類，限制了酸性植酸酶的應用范圍。(2)來源于芽孢桿菌的中性植酸酶(phyC)，它具有更高的熱穩定性，在飼料制?；蚺蚧^程中引起的酶活損失少，最適酶促反應pH在7.0～7.5，適合于鯉科魚類飼料，可以彌補酸性植酸酶的不足，但其酶活性不高。(3)主要來源于大腸桿菌的雙功酶(appA)，它具有植酸酶和磷酸酶的功能，但只在酸性條件下表現出強的植酸酶活性。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種來自于微生物的具有分解植酸、植酸鹽及其絡合物釋放出磷的植酸酶基因，其表達產物不僅酶促反應最適PH為中性，而且酶活性很高，將其轉入植物使之表達，可分解植物收獲物中的植酸、植酸鹽及其絡合物，釋放出磷等礦物營養元素，不但植物自身可以吸收利用，而且也有利于食用此植物的動物的吸收利用。?

本發明申請人利用枯草芽孢桿菌基因組為模板，設計了一對中性植酸酶phyC引物，然后進行克隆，得到了一段序列。于上海invitrogen公司測序三次，堿基序列均一致，第一次為TA克隆測序，第二次為將此段基因連接在表達載體pPIC9K上的測序，第三次為用高保真酶進行的TA克隆測序，其DNA堿基序列和氨基酸序列均與已報道的植酸酶基因序列有異。?

本發明的枯草芽孢桿菌中性植酸酶phyC基因通過以下步驟得到：?

(1)首先根據NCBI上已報道的中性植酸酶phyC基因(登錄號為AY220075)(Hongning，W.，Qi，W.，Yong，H.，Likou，Z.and?Shigui，L.Cloning?of?the?phytase?gene(phyC)from?Bacillus?subtilis?and?its?overexpression?in?Escherichia?coli.Submitted(17-JAN-2003)College?of?Animal?Science?and?Technology)設計引物，上游為：5′TAC?gTA?ATg?AAT?CATTCA?AAA?ACA?CTT?3′，下游為：5′gCA?CTA?gTT?TAT?TTT?CCg?CTT?CTg?TCA；在上游添加SnaBI限制性酶切位點；?

(2)將枯草芽孢桿菌擴大培養并提取其基因組，然后以其為模板，用設計的特異性引物進行擴增，獲得目的條帶，PCR產物回收后與pGEM-T載體連接轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得陽性克隆后送往上海invitrogen公司測序，測序結果表明擴增的序列與預期的結果一致；?

(3)將含有目的片斷的T克隆與pPIC9K空質粒分別用SnaBI和NotI進行雙酶切，分別回收目的片斷，以T4連接酶將其連接并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選獲得含有pPIC9K-phyC的克隆，然后將擴大培養的菌液送往上海invitrogen公司測序，測序結果與第一次測得的序列一致，獲得正確的克?。?