[發明專利]利用具有裸蛹性狀的雜交種雌蠶無性克隆系提高家蠶桿狀病毒系統表達外源基因效率的方法

有效

• 申請號: 200910102356.5
• 申請日: 2009-09-01
• 公開（公告）號: CN101638667A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 王永強;孟智啟;祝新榮;何秀玲;柳新菊;丁農;姚陸松;張金衛;周文林;劉培剛;胡桂燕
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;A01K67/04
• 代理公司: 杭州華鼎知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 韓 洪

技術領域

本發明涉及特殊用途家蠶新品種選育及利用基因工程技術表達外源基因，確切地說以育成具有裸蛹性狀的雜交種雌蠶無性克隆系(高發生率和孵化率、后代全雌、蛹體大、生命力強)為宿主，有效提高利用桿狀病毒系統表達外源基因效率的一種方法。

背景技術

利用生物反應器表達外源基因來生產昂貴的醫用活性物質是目前生物技術工程的研究熱點，具有巨大的經濟效益和社會效益，市場前景廣闊。昆蟲作為生物反應器表達外源基因能夠直接在生物體內形成具有活性的表達產物，家蠶屬于鱗翅目昆蟲，是利用基因工程技術生產活性物質的理想生物反應器。自日本學者前田進1985年成功利用家蠶桿狀病毒表達系統成功表達外源基因以來，至今已有人與小鼠介素3、介素4(IL-3，IL-4)，人免疫缺陷病毒(HIV-I即艾滋病毒)的核心蛋白(gsg)，人乙型肝炎病毒表面抗原(HBV52-sAg)，人丙型肝炎抗原，人血小板因子IV(HPF4)等數百種外源基因在家蠶中表達。由于我國蠶業有著悠久的歷史，大規模飼養推廣體系健全，這為家蠶作為生物反應器表達外源基因產業的發展提供了很大空間。

家蠶作為生物反應器用桿狀病毒表達系統表達外源基因的過程中，需要將含外源基因的病毒液注射到幼蟲或蛹體內，很多情況下是以蛹材料。因此，現行品種需要將繭子削開、蛹倒出，往往造成蛹體受傷，給大規模操作帶來不便，也不利于無菌消毒。若能選擇裸蛹品種(不吐絲，直接化蛹)，就為家蠶表達外源基因提供了便利。另外，同品種的雌雄個體外源基因的表達量也不同，劉金明等(中國獸醫寄生蟲病，2005，13(1)：5～7)以重組病毒rSj14NPV為感染病毒，分別在不同的家蠶品種秋豐×白玉、871×872中表達脂肪酸結合蛋白(Sj14)，通過純化蛋白的產量比較，同品種的雌蠶表達量高于雄蠶，純化的蛋白表達量分別為：871×872雌蠶表達量5.09mg/條蠶、雄蠶4.86mg/條蠶(提高4.73％)；秋豐×白玉雌蠶5.04mg/條蠶、雄蠶4.72mg/條蠶(提高6.78％)。因此，若能育成兼具裸蛹性狀、后代全部為雌性個體的品種，以其為宿主表達外源基因，將有效提高外源基因表達量和表達效率。

雌蠶無性克隆不同于有性生殖，是卵細胞在未受精的情況下直接發育成雌性個體的現象。在自然狀態下，無性克隆的發生率很低，僅為0.004％，而利用性別控制技術，通過對卵細胞生活周期中染色體的調控，改變細胞發生的自然過程，不僅能達到單一雌性孵化的目的，也可提高其發生率。

在卵細胞的生活周期中，減數分裂是配子形成的必要階段，包括二次分裂過程。第一次分裂使染色體數目減半，第二次分裂形成4個單倍體(n)的配子。在有性生殖方式下，卵子與精子通過受精形成二倍體(2n)，從而保證了親代與子代間染色體數目的恒定性。而利用性別控制技術可抑制第一次分裂，卵細胞不經過染色體數目減半直接進入第二次分裂，成為二倍體分裂核(2n)，這樣發育成的個體持有與母體完全相同的染色體組，連續以此方式繼代可獲得基因型完全相同、全部為雌性的群體，即為“雌蠶無性克隆系”。

俄羅斯科學院Astaurov和Strunnikov院士等通過30多年的研究，建立了歐洲一化性品種簡單有效的溫湯處理誘導雌蠶無性克隆的方法。我們從1996年開始，以我國二化性蠶品種為材料進行雌蠶無性克隆系的研究工作。首先針對我國二化性品種的特點，優化了溫湯處理的技術條件(王永強等，浙江農業科學，1997(增刊)：62～63)，首次闡明了雌蠶無性克隆發生率性狀的遺傳規律(王永強等，蠶業科學，2004，30(2)：133～136)，育成了高發生率和孵化率、繭絲質性狀優良的二化性中、日系雌蠶無性克隆系(原種)，并在育種和蠶種生產上得到了應用，以其為母本，經濟性狀優良的限性卵色品種為父本，建立了“單交制種”的新模式，能有效降低蠶種生產成本(王永強等，蠶業科學，2007，33(2)：335～339；何克榮等，2007，33(3)：462～465)。雌蠶無性克隆系除了在家蠶育種和蠶種生產上具有很好的利用價值外，由于其后代為全雌、蛹體相對較大、基因型完全一致等特點，在其它領域也將具有開發利用價值，但還沒有這方面的研究報道。本發明為提高家蠶桿狀病毒系統表達外源基因的效率，針對性的選育適合基因工程操作具有裸蛹性狀的雜交種雌蠶無性克隆系(高發生率和孵化率、后代全雌、蛹體大、生命力強)作為外源基因表達的宿主。

發明內容

本發明的一個目的是提供以育成具有裸蛹性狀的雜交種雌蠶無性克隆系(高發生率和孵化率、后代全雌、蛹體大、生命力強)為宿主，有效提高利用桿狀病毒系統表達外源基因效率的一種方法。