[發明專利]一種肝癌靶向性基因表達元件AP及其應用

無效

• 申請號: 200910101816.2
• 申請日: 2009-08-27
• 公開（公告）號: CN101671670A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 曹江;賈振宇;陳萍;毛晨宇
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A61K48/00;A61P35/00;A61P1/16
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬生物技術，涉及基因表達調控，具體地說，涉及一種特異性針對 甲胎蛋白陽性肝癌的靶向性基因表達元件AP的設計、制備及其在甲胎蛋白陽 性的肝癌細胞內特異表達、其轉錄產物經細胞內加工后可以有效地抑制肝癌細 胞內DNA聚合酶的表達，使細胞內DNA復制因DNA聚合酶?缺乏而無法 進行，從而達到抑制肝癌細胞增殖的作用。本發明可用于制備靶向性腫瘤基因 治療藥物。

背景技術

惡性腫瘤是目前人類主要“殺手”之一，近年來隨著人們生活方式及環境的 改變，其發病率呈上升趨勢，在許多城市已成為第一位死亡原因，在農村位列 第二位。肝癌在我國是最常見的危害極大的惡性腫瘤之一，和肺癌、胃腸道腫 瘤、乳癌等其它常見惡性腫瘤相比，目前的手術和化療等常規方式的療效和預 后均不理想。

被稱為腫瘤治療新模式的生物治療目前正顯示出越來越良好的應用前景。 在各種腫瘤生物治療手段中，基因治療始終是一個主要方向，我國研制的世界 上第一個正式進入臨床使用的基因藥物、針對許多腫瘤細胞中發生突變的抑癌 基因p53的、可表達野生型p53的腺病毒注射液“今又生”即是其代表。隨著醫 學分子生物學技術和知識的飛速發展，各種先進的分子生物學手段都運用到腫 瘤的基因治療研究中。但是由于腫瘤的發生發展涉及眾多基因，而目前的研究 大都僅針對個別靶基因，因此，這些研究雖然都顯示出較好的細胞水平的體外 抑瘤效果甚至荷瘤動物模型的體內抑瘤效應，但實際效果并不理想。因此，探 索、嘗試新的腫瘤基因治療手段具有十分重要的意義。

正常細胞在各種致癌因素的作用下逐漸發生變化直至最后發生癌變，有相 當多的基因表現出過度表達的現象，尤其是一些促進細胞生長、侵襲等惡性表 型的基因的過量表達。針對腫瘤中異常表達的基因，人們設計了許多靶向性基 因治療的方法，其中以封閉促進腫瘤生長、侵襲等相關基因的表達的研究是一 個相當熱門的領域。在以往大量的研究中，人們利用反義RNA(antisense?RNA) 對腫瘤細胞高表達基因進行封閉，但由于反義RNA本身存在的限制，這類研 究在抑制腫瘤細胞生長、控制細胞侵襲遷移等方面雖然取得了較大的成績，其 封閉基因表達的效果仍不理想。

小干擾RNA(small?interfering?RNA，siRNA)的發現為人為干預細胞中基 因的表達提供了一個有力的工具。利用化學合成的雙鏈形式的siRNA，或是由 III型啟動子帶動轉錄的結構類似的小發卡樣RNA(small?hairpin?RNA， shRNA)，可以通過序列特異性匹配原則降解靶基因，從而對靶基因的表達進 行有效的抑制，因此也被嘗試應用于基因治療。但是由于化學合成的siRNA代 價太高，而shRNA的表達又不利于調控，這些因素大大地限制了這一技術的 應用。

微小RNA(microRNA)是細胞內天然存在的一種小分子RNA，是在基因 轉錄后水平進行表達調控的一種重要方式，能在序列完全匹配的情況下降解靶 基因mRNA，也可以在序列非完全匹配的情況下抑制靶基因的翻譯，是目前生 命科學領域中的一個研究熱點，在腫瘤相關microRNA方面也有大量研究，而 且大都集中在正常細胞和腫瘤細胞之間表達有差異的各種天然microRNA的發 現以及功能鑒定。

由于天然microRNA是由II型啟動子帶動轉錄，因此如果人工設計類似的 microRNA分子，也應該可以由II型啟動子引導轉錄，而II型啟動子的特點是 其轉錄啟動功能可以調控，所以其下游的人工miRNA的表達應該可以受到人 為控制，而microRNA的作用方式最近的一些文獻報道已證實這一設想。

在本發明中我們選擇細胞周期中的DNA復制這一重要環節為靶點，設計 人工microRNA的序列，抑制DNA復制中的關鍵酶的表達，通過阻斷DNA復 制而使細胞周期停止。由于DNA的復制是一個復雜而又精密調控的過程，主 要由DNA聚合酶、和等酶催化、以原有的DNA鏈為模板進行的半保 留復制，因此對DNA聚合酶?的抑制將有效阻斷細胞的DNA復制，從而使 細胞周期因DNA無法復制而停止，進而抑制細胞的增殖。