[發明專利]香蕉苞片花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑及制備方法和應用無效
| 申請號： | 200910099586.0 | 申請日： | 2009-06-12 |
| 公開（公告）號： | CN101591716A | 公開（公告）日： | 2009-12-02 |
| 發明（設計）人： | 聞偉剛;楊文潮 | 申請（專利權）人： | 寧波檢驗檢疫科學技術研究院 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/94 |
| 代理公司： | 寧波奧圣專利代理事務所（普通合伙） | 代理人： | 程曉明 |
| 地址： | 31501*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 香蕉 花葉 病毒 實時 熒光 rt pcr 檢測 試劑 制備 方法 應用 | ||
1.香蕉苞片花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑，其特征在于包含一對特異性引 物和一條特異性熒光探針，擴增目標核苷酸序列的片段長度為74bp，引物和探針序列 為如下所示：
引物：BBrMV?TF：5′-caaaaactacgaacagggctagaga-3′
BBrMV?TR：5′-ccgagtgtttgatccacgaa-3′
探針：5′-FAM-cacacacgcagatgaaagctgcagc-Eclipse-3′。
2.制備權利要求1所述的檢測試劑的方法，其特征在于由下述步驟組成：
(1)選擇香蕉苞片花葉病毒CP編碼基因的保守片段為靶目標，該保守片段的擴增 目標核苷酸序列為：
caaaaactac??gaacagggct??agagaagcac?acacgcagat??gaaagctgca??50
gctattcgtg??gatcaaacac??tcgg???????????????????????????????74
(2)應用primer?Express?3.0軟件，設計合成引物和探針；
(3)引物和探針的合成采用β-乙腈磷酸胺化學合成法，使用全自動DNA合成儀進 行OligoDNA的合成；
(4)探針合成同時進行兩端熒光標記，探針5′端標記的熒光報告基團為FAM，3′ 端標記的是不發熒光的淬滅基團Eclipse；
(5)將設計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物 和探針；
(6)經過大量的反應條件優選、對比試驗和驗證試驗，并經過大量實際樣品的檢 測應用評估，得到擴增效率和特異性好的所述的引物和探針。
3.權利要求1所述的檢測試劑在制備BBrMV實時熒光RT-PCR標準化試劑盒中的 應用。
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