[發明專利]一種骨髓間充質干細胞體外培養基及其應用

有效

• 申請號: 200910099469.4
• 申請日: 2009-06-08
• 公開（公告）號: CN101586095A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 王建安;劉先寶
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K35/28;A61P9/10
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種加有添加劑的骨髓間充質干細胞體外培養基以及利用其增強骨髓間充質干細胞(MSCs)移植后生存能力和血管新生能力的預處理方法，以提高細胞移植修復組織損傷的效能。

(二)背景技術

如今心腦血管疾病已經成為人類健康的頭號殺手，盡管近年來藥物治療和介入治療得到了快速發展，缺血性心肌病患者的預后有了明顯的改善，但藥物治療和介入治療終歸不能修復壞死的心肌。骨髓間充質干細胞(MSCs)具有自我更新能力和橫向分化能力，移植到心梗局部后能夠分化為內皮細胞、血管平滑肌細胞和心肌細胞樣細胞，促進新生血管的形成。大量的基礎研究和臨床前期研究發現MSCs能夠挽救瀕死的心肌，減小心梗面積進而改善心肌梗死后的心功能，因此骨髓間充質干細胞在心血管疾病中的應用是近年來研究的熱點，成為攻克心血管疾病難題的一種非常有前景的治療手段。但是，MSCs改善心功能的能力有限，大量的證據表明MSCs移植對心功能的改善是輕中度的，大部分研究結果顯示MSCs移植對心功能的改善只有5-6％左右，甚至有些臨床試驗沒有觀察到心功能的改善，這遠遠達不到我們的預期，其中很重要的原因是絕大多數的細胞移植到體內后在很短的時間內發生死亡，研究報道90％的MSCs在移植后的1天內死亡，另外與MSCs在移植到惡劣環境后的新生血管能力受限有密切關系。因此，找到一種既能夠提高MSCs生存能力又能改善MSCs功能的方法顯得尤為迫切。

DMOG(dimethyl-oxalylglycine)是一種脯氨酰羥化酶抑制劑，能夠抑制細胞內HIF-1α的降解，繼而使細胞核內很多下游基因(如EPO、VEGF、Ang1和Glut-1等)的轉錄和表達增高，繼而發揮其抗凋亡、促生存和促血管新生等保護性作用。在缺血再灌注心肌損傷和急性心肌梗死的動物模型中發現，DMOG能夠發揮降低大鼠的心肌重構和抑制炎癥反應等保護作用。在體外的研究中發現，DMOG能夠改善腫瘤細胞和神經元在缺血清或缺神經營養因子等惡劣環境下的生存能力。

(三)發明內容

本發明提供了DMOG預處理改善骨髓間充質干細胞移植后的生存能力和血管新生能力的處理方法，旨在提高骨髓間充質干細胞移植治療缺血性心臟病的能力。

本發明采用的技術方案是：

一種骨髓間充質干細胞體外培養基，其特征在于所述的培養基由常規細胞培養基中加入終濃度為500～2000μmol/L的DMOG制得。所述的常規細胞培養基是指現有技術中通常有來培養為骨髓間充質干細胞體外培養基，如α-MEM、DMEM-HG或DMEM-LG等等都可以。本發明的發明要點在于在常規培養基中添加了DMOG。

一種增強骨髓間充質干細胞移植后生存能力和管腔形成能力的處理方法，所述的方法主要是利用的本發明所說的骨髓間充質干細胞體外培養基，所述方法包括：將經傳代培養穩定的骨髓間充質干細胞置于DMOG終濃度500～2000μmol/L的細胞培養基中，常規培養24～36小時，獲得處理后的骨髓間充質干細胞用于細胞移植。所述傳代培養按常規方法在常規氧濃度(即常氧培養)條件下進行，通常的，所述常規培養為：在CO₂體積濃度5％、O₂體積濃度95％的混合氣體中培養。

所述細胞培養基為常規適用于骨髓間充質干細胞體外培養的培養基，如低糖DMEM培養基(即DMEM-LG)等。本發明處理方法培養條件與常規骨髓間充質干細胞體外培養條件相同，只是在培養基中添加了終濃度500～2000μmol/L的DMOG。

所述培養是指培養在常規氧濃度條件下進行，通常的，所述培養為：在CO₂體積濃度5％、空氣體積濃度95％的混合氣體中培養。

本申請發明人發現，DMOG預處理能激發細胞內源性保護機制，通過細胞內多條信號傳導通路，增強細胞的生存能力和/或血管新生能力。研究發現，DMOG預處理(培養基中終濃度為500～2000μmol/L，優選為1mM)能降低骨髓間充質干細胞內HIF-1α的降解，提高其下游Glut-1和VEGF的表達，并明顯激活了Akt通路，同時明顯提高了MSCs的管腔形成能力。

優選的，所述方法如下：將繼代第3代的骨髓間充質干細胞置于DMOG終濃度為1000μmol/L的含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基中，于37℃下、在CO₂體積濃度5％、空氣體積濃度95％的混合氣體中，培養24小時，獲得處理后的骨髓間充質干細胞用于細胞移植。