[發(fā)明專利]一種檢測(cè)齊帕特羅的直接競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910099442.5
• 申請(qǐng)日: 2009-06-15
• 公開（公告）號(hào): CN101571542A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王旻子;于洪俠;張明洲;程曄;魏建良
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州迪恩科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N33/52;G01N21/31;G01N33/535
• 代理公司: 杭州宇信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所（普通合伙）
• 代理人: 張宇娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一 種用于檢測(cè)齊帕特羅的直接競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫試劑盒。

背景技術(shù)

齊帕特羅(Melamine)，化學(xué)名稱為(+/1)-反式-4，5，6，7-四氫-7-羥基-6-(異丙 基氨基)咪唑并[4，5，1-jk]-[1]苯并氮雜卓-2(1H)-酮，也是β-興奮劑，與克倫特 羅(俗稱“瘦肉精”)具有同樣的生理效應(yīng)，能導(dǎo)致人或動(dòng)物心臟衰竭，肌肉 震顫，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡。齊帕特羅與其他β-興奮劑通常屬于違禁藥物。

然而，隨著瘦肉精和萊克多巴胺等藥物檢測(cè)方法的成熟和檢測(cè)，以及對(duì)其 打擊力度的加大，齊帕特羅等同類藥物有被不法人員應(yīng)用的趨勢(shì)。因此有必要 建立對(duì)齊帕特羅進(jìn)行檢測(cè)的方法，禁止此類事件的發(fā)生，保障食品安全。

現(xiàn)有的齊帕特羅檢測(cè)方法為色譜法，但是這些方法需要有完善的實(shí)驗(yàn)室， 有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，復(fù)雜的儀器設(shè)備，且檢測(cè)過程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)大量樣本 的篩查。基于抗原抗體免疫反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)為小分子殘留物的分析檢測(cè) 提供了一個(gè)新的途徑。基于此原理建立的直接競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)較間接 方法進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間。該技術(shù)的關(guān)鍵是完全抗原和酶標(biāo)記抗原的合成及 抗體的制備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括： 齊帕特羅特異性抗體、包被有齊帕特羅特異性抗體的酶標(biāo)板、齊帕特羅辣根過 氧化物酶標(biāo)記物及其工作液。其中齊帕特羅特異性抗體為兔抗齊帕特羅的多克 隆抗體，用齊帕特羅與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動(dòng)物(例如兔)制 得。所述的齊帕特羅辣根過氧化物酶標(biāo)記物采用化學(xué)方法偶聯(lián)得到，標(biāo)記酶為 辣根過氧化物酶，所述偶聯(lián)方法為戊二酸酐法。

用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙 烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。

為方便現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括包被有齊 帕特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液、混合顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。

所述的洗滌液為0.05％-0.5％吐溫-20磷酸鹽緩沖液。所述的混合顯色 劑由顯色劑A液和顯色劑B液按兩種液體的體積比1∶1的比例混合而成，含 有底物過氧化氫或過氧化脲，以及供氫體鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，此種混合 顯色劑在4℃下可以保存兩年不變色。所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1％吐溫 -20的磷酸鹽緩沖液。所述的齊帕特羅辣根過氧化物酶標(biāo)記物工作液為直接 可以應(yīng)用的液體，達(dá)到最佳應(yīng)用濃度，不需再稀釋。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)飼料樣品中齊帕特羅含量的方法，包 括步驟：

(1)樣品前處理；

(2)用權(quán)利要求1-9任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，向包被有齊帕特羅抗體 的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入齊帕特羅辣根過氧化物酶標(biāo)記物 工作液，室溫溫育30分鐘，洗板4次，加混合顯色劑室溫溫育15分鐘、終止 液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；

(3)分析檢測(cè)結(jié)果。

本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理為：

將齊帕特羅抗體包被于固相載體上，加入樣本或齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加 入酶標(biāo)記齊帕特羅辣根過氧化物酶標(biāo)記物工作液，待測(cè)樣品中的齊帕特羅與酶 標(biāo)記齊帕特羅競(jìng)爭(zhēng)固相化的齊帕特羅抗體，通過洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物， 顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中齊帕特羅的量呈負(fù)相關(guān)，與 標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出齊帕特羅濃度范圍。

有益效果：

本發(fā)明檢測(cè)齊帕特羅的試劑盒主要采用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定法定性或 定量檢測(cè)樣品中齊帕特羅含量；進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間為1個(gè)小時(shí)以內(nèi)，對(duì)樣 品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品。

本發(fā)明該試劑盒采用高特異性的齊帕特羅多克隆抗體，主要試劑以工作液 形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時(shí)間并降低因操作步驟 冗繁造成的誤差，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高精確度、高準(zhǔn)確度、對(duì) 儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程度高、無放射性同位素污染的等 優(yōu)點(diǎn)，可在飼料及動(dòng)物源性產(chǎn)品檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1為齊帕特羅抑制曲線。