[發(fā)明專利]一種固定的膽堿酯酶及其制備和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910098674.9
• 申請日: 2009-05-19
• 公開（公告）號: CN101586100A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 繆煜清;馬倩倩
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江師范大學(xué)
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12N11/02;C12Q1/46
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 馮子玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種酶產(chǎn)品及其加工和應(yīng)用，具體為一種用水溶性材料 固定的膽堿酯酶及其制備，以及在農(nóng)藥殘留快速檢測或者膽堿酯酶抑制劑的篩選的應(yīng)用。

背景技術(shù)

膽堿酯酶是人和動物體內(nèi)的重要酶，它包括乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。有機磷、氨 基甲酸酯類農(nóng)藥或毒劑能夠抑制膽堿酯酶的活性。許多生物毒素或者活性成份也抑制膽堿酯 酶活性，能夠應(yīng)用于老年癡呆癥和許多神經(jīng)性疾病的治療。利用膽堿酯酶的抑制作用能夠檢 測食品或環(huán)境中的農(nóng)藥殘留，也可以用于神經(jīng)性疾病的藥物篩選。

但是膽堿酯酶在體外不容易保存，通常需要冷凍保存，使用前需要溶解分裝，使用很不 方便。各種物理或者化學(xué)方法被用于膽堿酯酶的固定，但這些方法往往造成酶活性的損失。 通常的酶固定總是將酶固定在固體材料的內(nèi)部或者表面，酶的反應(yīng)是非均相反應(yīng)，催化效率 低，而且也不便于檢測。此外，常規(guī)酶固定技術(shù)希望通過固定使得酶可以多次使用，固定膽 堿酯酶用于農(nóng)藥檢測卻不適合多次使用，因為待測農(nóng)藥會抑制酶的活性，使得固定化酶只能 一次性使用，即使可以采用某些藥物使膽堿酯酶部分回復(fù)活性，但操作繁瑣，成本高，重現(xiàn) 性也不好。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對膽堿酯酶穩(wěn)定性差，固定后酶活性降低，使用時不能進行均相反應(yīng)等問題， 提供一種固定的膽堿酯酶，以及其制備方法。

本發(fā)明的一種固定的膽堿酯酶，其固定膽堿酯酶所用的載體是能夠干燥成膜并在水溶液 中迅速溶解的水溶性材料；所述水溶性材料為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯樹膠；也 包括上述水溶性材料與脂質(zhì)體形成的復(fù)合材料。

本發(fā)明一種固定的膽堿酯酶的制備包括以下步驟：

(1)從動物的離體組織或者體液中提取膽堿酯酶，或直接采用商業(yè)化乙酰膽堿酯酶或丁 酰膽堿酯酶為原料，用保護劑稀釋為所需濃度的膽堿酯酶稀釋液，所用保護劑選用1～10 mg/mL的牛血白蛋白磷酸鹽緩沖液；

(2)將權(quán)利要求1中所述水溶性材料按照1％～50％的重量體積百分比溶于水，獲水溶 性材料溶液；

(3)將膽堿酯酶稀釋液與水溶性材料溶液按1∶4～4∶1的體積比混合均勻，獲膽堿酯酶 水溶性材料溶液；

(4)用滴加或浸泡的方法直接將膽堿酯酶水溶性材料溶液附著到固體材料上，干燥成薄 膜，或滴加到模具中干燥成酶顆粒；所述固體材料為塑料。

步驟(1)所述保護劑中含有重量體積百分比0.1％～1％的硫柳汞。

所述脂質(zhì)體是磷脂或者磷脂與以下物質(zhì)中的一種或多種的混合物：膽固醇、十八胺、磷 脂酸和油酸；所述磷脂為卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、豆磷脂二棕櫚酰磷脂、鞘磷 脂或二硬脂酰磷脂酰膽堿。

所述在水溶液中迅速溶解的水溶液是指水，或水與乙醇、丙酮、異辛烷或環(huán)己烷形成的 有機溶劑或這些有機溶劑兩種以上混合的水溶液。

本發(fā)明所述一種固定的膽堿酯酶的應(yīng)用特點是：使用時將所述一種固定的膽堿酯酶投入 待測溶液中，直接用于農(nóng)藥和神經(jīng)毒劑的檢測或者用于膽堿酯酶抑制劑的篩選。

采用水溶性材料固定膽堿酯酶，固定膽堿酯酶后干燥成膜，使用時投入溶液中立即溶解 釋放其中的酶分子，在均相中行使催化功能，具有更好的催化效率和抑制靈敏度，應(yīng)用在農(nóng) 藥殘留快速檢測或者膽堿酯酶抑制劑的篩選。

本發(fā)明一種固定的膽堿酯酶的優(yōu)點是：

使用時將含酶的水溶膜或塊體投入到可能含有有機磷或者氨基甲酸酯農(nóng)藥的溶液中，加 入酶底物溶液，肉眼觀察或者采用儀器定量。由于水溶性材料在水中快速溶解，釋放出其中 的膽堿酯酶，使得抑制和催化過程都在均相中進行，酶活性增大，抑制靈敏度提高。

由于酶被分散固定在酶膜內(nèi)，使用時不需要稱量、溶解、分裝等步驟。直接將酶膜投入 到檢測液中，使用非常方便。此外，酶膜可以采用真空包裝，直接室溫保存，或者4℃冰箱 冷藏。

具體實施方式

實施例1：

(一)乙酰膽堿酯酶固定

(1)配置10mM?pH8磷酸鹽緩沖液(PBS)。

(2)將購買的商業(yè)化純乙酰膽堿酯酶用含有1～10mg/mL的牛血白蛋白磷酸鹽緩沖液 稀釋，濃度為1U/mL。

(3)稱量聚乙烯吡咯烷酮，溶于水，按重量體積百分比配置1～10％的聚乙烯吡咯烷酮 溶液。