[發明專利]用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒

無效

• 申請號: 200910098560.4
• 申請日: 2009-05-14
• 公開（公告）號: CN101555527A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 郭仁勇;陳瑜;李蘭娟;魯海峰;陳珍晶
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/865
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 唐銀益

技術領域

本發明涉及一種試劑盒，具體涉及一種用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒。

背景技術

在正常人類腸道中存在一個豐富、多樣的真菌群落。人們采用傳統的分離培養法已經對人類腸道真菌進行了許多研究(Khatib?R，Riederer?KM，Ramanathan?J，et?al.Faecal?fungal?flora?inhealthy?volunteers?and?inpatients.Mycoses，2001，44：151-6.)，該方法通過對真菌表型進行診斷，觀察固體培養基上的菌落生長和繁殖情況，根據菌落形狀、大小、顏色、粘性以及其他結構特征鑒定真菌，結合不同的生理、生化和耐熱性試驗等進行形態學診斷。運用分離培養法可以準確的診斷某些致病性真菌，但是，在某些特殊情況下，比如分離培養的菌落形態不典型、特殊培養基無法獲取、培養時間過長、表型結果非特異等等，則無法對真菌病原體進行準確診斷，需要依靠非培養診斷技術進行真菌鑒定。

實時熒光定量PCR技術已經廣泛應用于微生物的各個領域(Espy?MJ，Uhl?JR，et?al.Real-time?PCR?in?clinical?microbiology：applications?for?routine?laboratory?testing.Clin?Microbiol，2006，Rev?19(1)：165-256.)。該技術不僅能夠從本質上增加病原體檢測的靈敏度，結合種特異性引物和擴增產物融解曲線分析可以特異的檢測和鑒定某種病原體，檢測過程無需分離培養，操作簡便、快速，極大的縮短了診斷時間；并且可以作為病原體感染患者治療療效的監測手段。但是，由于人類腸道微生態群結構復雜，存在大約10¹⁴個不同的微生物有機體，而真菌所占比例較低，不到1％；某些真菌菌種的生長還需要復雜的培養條件，分離培養法只能檢測到一小部分條件適合的微生物，檢測靈敏度低且診斷周期長。而實時熒光定量PCR技術是基于對病原體核苷酸的檢測，不受培養條件限制且檢測靈敏度高，有利于更加準確、全面的了解真菌群落在腸道病理生理過程中的作用。利用實時熒光定量PCR技術能夠準確、快速的檢測和鑒定真菌病原體，這對于及時治療和有效控制腸道真菌感染都至關重要。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒。

為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：

提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒，該試劑盒包括：

反應總體積1/10的10×Taqman?PCR?buffer；

各0.15μmol/L～1μmol/L的上游和下游引物；

各200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；

2.0mmol/L～3.5mmol/L的MgCl₂；

0.05U/μl?HOTSTART?Taq?DNA聚合酶；

0.02×SYBR?green?I熒光染料；

標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋；

余量為無菌雙蒸水；

所述兩條引物為PCR擴增過程中使用的特異性擴增釀酒酵母菌ITS區的引物：

上游引物序列為：5’-TACTTACCGAGGCAAGCTGCA-3’(SEQ?ID?NO：1)

下游引物序列為：5’-AGGCGTGCGGTTCTTTG-3’(SEQ?ID?NO：2)

所述標準陽性模版為釀酒酵母菌標準菌株DNA經前述引物擴增，擴增產物與pGEMT-TEasy載體連接后獲得的標準質粒DNA；編碼所述擴增產物的基因具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

操作簡便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對核苷酸的檢測，不受培養條件限制；定量檢測，能真實反映腸道釀酒酵母菌定植和發生感染的情況；可同時進行高通量的樣本檢測。本發明提供的試劑盒可對腸道釀酒酵母菌進行快速定量檢測，可以替代一直沿用的分離培養的傳統診斷方法，并適于在臨床實驗室廣泛推廣應用。

附圖說明

圖1為將本發明試劑盒標準陽性模版梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增所得的動力曲線圖，橫坐標代表循環數，縱坐標代表相對熒光強度，圖中平行于橫坐標的直線代表熒光閾值。

圖2為將本發明試劑盒標準陽性模版梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增所得的標準曲線圖，橫坐標代表熒光閾值，縱坐標代表不同稀釋度標準陽性模版的濃度。