[發(fā)明專利]β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910097732.6
• 申請(qǐng)日: 2009-04-20
• 公開（公告）號(hào): CN101914612A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳揚(yáng);張加慧;劉翔;劉國(guó)安;劉沐榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州北望生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/34
• 分類號(hào): C12Q1/34;G01N21/78
• 代理公司: 杭州金源通匯專利事務(wù)所(普通合伙) 33236
• 代理人: 唐迅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品安全檢測(cè)試劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒以及β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

自20世紀(jì)40年代第一個(gè)β-內(nèi)酰胺類抗生素——青霉素問世以來，抗生素在細(xì)菌感染性疾病的治療中發(fā)揮了重要作用，95％以上由細(xì)菌感染引起的疾病得到控制。然而隨著β-內(nèi)酞胺類抗生物藥物的不斷開發(fā)和在臨床上的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株越來越多，其中最主要的耐藥機(jī)制是這些菌株能產(chǎn)生β-內(nèi)酸胺酶。

研究表明β-內(nèi)酰胺酶是水解β-內(nèi)酰胺類抗生素分子中β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的一類酶，根據(jù)酶蛋白的氨基酸序列的同源性分為A類、B類、C類及D類，其中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum?β-lactamases，ESBL)是分解β-內(nèi)酰胺類抗生素底物范圍比以往的A類β-內(nèi)酰胺酶更廣的酶。β-內(nèi)酞胺酶水解抗生素，使之失去抗菌活性，從而導(dǎo)致臨床抗菌治療失敗。葡萄球菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌及部分腸球菌都是由此酶表現(xiàn)出抗藥性。

經(jīng)常使用抗生素會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生耐藥性的后果相當(dāng)嚴(yán)重，抗生素失去效果。對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的細(xì)菌感染應(yīng)用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療，不僅得不到治療效果，而且還成為新的耐性菌蔓延的原因，引起病人住院時(shí)間延長(zhǎng)、費(fèi)用增加和死亡率上升。因此，在確定正確的治療方案前必須迅速且正確地檢測(cè)這些病原菌是否產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，這對(duì)于快速識(shí)別耐藥菌株及控制耐藥菌株傳播有重要作用，也有助于相應(yīng)感染性疾病的治療和預(yù)防。

趙旺勝等于1997年報(bào)道了四種β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法(四種檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶方法的實(shí)驗(yàn)比較，南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(中文版)，1997年11月第17卷第6期)：(1)碘測(cè)量法：溶解青霉素G于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中(pH6.0)，制成6000mg/L，配制1％可溶性淀粉液和2％碘溶液，測(cè)定時(shí)取0.1ml青霉素溶液與2ml待測(cè)菌液混合，置室溫30分鐘，加2滴淀粉溶液，再加1滴碘液混合，10分鐘內(nèi)能使藍(lán)色完全消退的菌株為β-內(nèi)酰胺酶陽性株。(2)微生物法：將對(duì)青霉素敏感的指示菌接種在血平板上，平板中心貼每片1μg青霉素紙片，沿紙片周圍垂直劃線，接種待測(cè)菌，陽性和陰性對(duì)照菌，37℃孵育24小時(shí)，如待測(cè)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，則待測(cè)菌處的指示菌出現(xiàn)凹痕。(3)紙片法：取20張濾紙片(1cm×2cm)放入1ml青霉素溶液中浸濕，待紙片干后備用，用接種環(huán)挑取待檢菌5～10個(gè)菌落涂于紙片上，放入帶蓋的平板內(nèi)置37℃孵育30分鐘，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株可使紙片的顏色由藍(lán)紫色變黃。(4)酸測(cè)定法：取0.1ml青霉素酚紅溶液與2ml待測(cè)菌懸液混合，10-15分鐘內(nèi)變?yōu)辄S色為β-內(nèi)酰胺酶陽性。張堅(jiān)磊等1999年報(bào)道了應(yīng)用碘試紙條法快速檢測(cè)β-酞胺酶(陜西醫(yī)學(xué)檢臉，第14卷第1期1999年2月)，該法是在碘測(cè)量法的基礎(chǔ)上建立以青霉素為底物的試紙條法，菌落涂于試紙條上，通過試紙條顏色的變化判斷是否產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。

葉楓等對(duì)四種方法檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行了比較(四種方法檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的敏感性比較，《廣東醫(yī)學(xué)》，2004年5月第25卷第5期)，采用了紙片擴(kuò)散法、雙紙片協(xié)同法、Etest法和VITEK全自動(dòng)細(xì)菌分析法，這些方法需要通過培養(yǎng)耐藥菌及判斷抑菌圈，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，結(jié)果易受偶然因素影響，VITEK全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)及其藥敏卡檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便，但需要特殊的機(jī)器。中國(guó)專利CN200380107185.6公開了一種β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑組合物、β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒以及β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法，在產(chǎn)色頭孢菌素法中使用的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑組合物含有β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)底物與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。

以上方法是在臨床細(xì)菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)上檢測(cè)細(xì)菌是否產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶來判斷病原菌的耐藥性，適合臨床上檢驗(yàn)微生物產(chǎn)生的內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶。

另一方面，β-內(nèi)酰胺類抗生素由于毒性小、化療指數(shù)高、抗菌譜廣、價(jià)格便宜，在非臨床領(lǐng)域也獲得了廣泛的使用，比如畜牧業(yè)就大量使用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療奶牛乳腺炎，結(jié)果使奶源的抗生素殘留問題比較嚴(yán)重。鄭穎等研究了TEM-116型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶對(duì)牛奶中抗生素的清除(《中國(guó)抗生素雜志》，2008年2月第33卷第2期)，通過試驗(yàn)作者發(fā)現(xiàn)在不太苛刻的條件下β-內(nèi)酰胺酶很容易清除牛奶中殘留的青霉素G。中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)枺?00610051915.0)公開了一種β-內(nèi)酰胺酶、其制備方法及其應(yīng)用，其中也對(duì)β-內(nèi)酰胺酶對(duì)牛奶中殘留抗生素的去除效果進(jìn)行了研究，結(jié)果也表明β-內(nèi)酰胺酶在奶制品中可以分解β-內(nèi)酰胺類抗生素。這些結(jié)果似乎表明β-內(nèi)酰胺酶可以完全降解牛奶中殘留的抗生素，減少奶業(yè)的損失，有可能成為一種新型食品添加劑。