[發明專利]鮑魚HINT基因、蛋白質及其在制備抗癌藥物中的應用

有效

• 申請號: 200910097433.2
• 申請日: 2009-04-02
• 公開（公告）號: CN101519655A
• 公開（公告）日: 2009-09-02
• 發明（設計）人: 吳信忠;吳劉記
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;A61K38/46;A61P35/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 唐銀益

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及鮑魚體內的鮑魚HINT基因、蛋白質及其在制備抗癌藥 物中的應用。

背景技術

組氨酸三聚體核苷結合蛋白質(Histidine?triad?nucleotide?binding?protein，HINT) 是組氨酸三聚體蛋白超家族的成員，是一個具有核苷酸轉移酶和水解酶活性的家族，晶體結 構研究結果表明，HINT是其它四種組氨酸三聚體蛋白質超家族成員的祖先。自從HINT在牛 中被分離出來并被證明具有生物學功能后，許多HINT的同源物也依次從兔、人、甚至植物 中被克隆出來。研究表明該蛋白質在低等動物和高等動物中具有很高的結構和功能相似性， 而結構和功能的保守性，預示了HINT發揮著重要的生物學功能。研究報道表明，HINT蛋白 質參與了重要的生物學功能，包括物質代謝、轉錄調控、細胞生長、細胞凋亡等。目前，有 研究報道哺乳動物HINT在腫瘤細胞凋亡、腫瘤發生、發展中發揮了重要作用，而在無脊椎 動物中，HINT的研究只是停留在序列分析上，尚沒有報道證實無脊椎動物HINT的存在，功 能研究也有待于進一步探討。

鮑魚是一種重要的經濟貝類，素稱“海味之冠”，自古以來就是海產“八珍”之一。其 味道鮮美，營養豐富，含有較多的鈣、鐵、碘和維生素A等營養元素。除了具有較高的營養 價值外，鮑魚還具有較高的醫藥價值：鮑魚能養陰、平肝、固腎，可調整腎上腺分泌，具有 雙向性調節血壓的作用。另外，鮑魚體內還存在一些能抑制癌細胞細胞代謝的物質。但是， 由于對其相應的功能因子的研究并不深入，尤其是對一些人類腫瘤治療有益的基因研究較 少，從而限制了其進一步的發展利用。

發明內容

針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供了鮑魚HINT基因、蛋白質及其在制備抗 癌藥物中的應用。

為達到以上目的，本發明是通過這樣的技術方案來實現的：提供一種鮑魚HINT基因編碼 的蛋白質，具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。

本發明還提供了一種編碼前述蛋白質的基因，該基因具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序 列。

本發明還提供了前述蛋白質在制備抗癌藥物中的應用。

本發明的有益效果在于：

本發明獲得了鮑魚HINT的基因核苷酸全序列，并通過構建原核表達載體，表達了可溶 性的HINT蛋白質產品。該蛋白質具有促肝癌細胞凋亡作用，可以作為誘導細胞凋亡的組份 而在制備抗癌藥物中應用。

具體實施方式

本發明的下述實施例所使用分子生物學的方法均為已知的技術。

本發明的實現步驟包括：

1、以鮑魚血淋巴細胞總RNA為模板，構建鮑魚cDNA文庫，獲得HINT的基因核苷酸全 序列。

2、利用DNA重組技術將HINT基因編碼框的序列片段克隆到合適的pMD18-T載體(購自 Takara公司，日本)中，再經限制性內切酶酶切，與經同樣酶切的pET-28(a)原核表達載 體(購自Novagen公司，美國)連接，獲得重組表達質粒pET-28(a)-HINT。

3、將陽性重組質粒PET-28(a)-HINT轉化到表達宿主菌BL21(購自Tiangen公司，德 國)，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(購自Sangon公司，加拿大)誘導表達，SDS-聚丙烯酰胺凝 膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測。

4、將陽性表達菌液擴大培養，利用蛋白質純化試劑盒分離純化重組蛋白質，并進一步 利用質譜技術鑒定純化蛋白質。

5、培養肝癌細胞株Bel-7402(人肝癌細胞系Bel7402購自中國科學院上海細胞生物研 究所)，并用純化的蛋白質HINT進行溫浴反應、處理。

6、選擇不同的時間點收集處理過的細胞，分別用掃描電鏡、流式細胞儀及免疫印跡檢 測腫瘤細胞的凋亡情況。

具體的操作步驟如下：

1、鮑魚血淋巴細胞cDNA文庫的構建及篩選

提取鮑魚血淋巴細胞總RNA，根據SMART^TMcDNA?library?construction?kit(BD?Clotech 公司)構建cDNA文庫。利用引物PTriplEx2-F，5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’和 PTriplEx2-R，5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’對文庫陽性質粒進行PCR擴增并測序。