[發(fā)明專利]番茄抗黃化曲葉病毒病育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910097378.7
• 申請(qǐng)日: 2009-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN101560566A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉青靜;楊悅儉;王榮青;周國(guó)治;阮美穎;李志邈;姚祝平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 沈伾伾

1、番茄抗黃化曲葉病毒病育種的分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行：

(1)從育種分離世代材料提取DNA：將番茄抗黃化曲葉病毒病育種分離世代材料的種子，播種；待幼苗長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)，每植株取1片幼葉，用改進(jìn)的CTAB法提取DNA；

(2)篩選抗TYLCVD基因的SCAR分子標(biāo)記：根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，初選出抗番茄黃化曲葉病毒病基因的分子標(biāo)記，合成引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；并根據(jù)PCR擴(kuò)增的純合和雜合帶型以及人工苗期接種鑒定結(jié)果，從中篩選出適合自己育種材料的抗番茄黃化曲葉病毒病基因Ty-2和Ty-3的SCAR分子標(biāo)記；Ty-2上、下游引物的序列分別如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示，Ty-3上、下游引物的序列分別如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示；

(3)雙重PCR反應(yīng)體系的建立與電泳分析檢測(cè)：Ty-2和Ty-3基因的雙重PCR反應(yīng)體系為：擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為10微升，0.7μL?DNA模板，0.2μL?10mmol·L^-1dNTPs，50ng·μL^-1的Ty-2上、下游引物各0.125μL，50ng·μL^-1的Ty-3上、下游引物各0.125μL，1μL含20mmol·L^-1Mg²⁺的10×反應(yīng)緩沖液，2U·μL^-1的Taq酶0.25μL，無(wú)菌純水7.35μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2min預(yù)變性后，接著94℃變性30s，54℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物于1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離分析、EB染色，在Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)上自動(dòng)成像；

(4)依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)育種分離世代材料抗性的評(píng)價(jià)：依據(jù)成像對(duì)育種分離世代材料抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，若擴(kuò)增條帶中含有900bp和/或450bp大小的DNA條帶，則該材料中含有抗番茄黃化曲葉病毒病的Ty-2和/或Ty-3基因；若反之，則該材料中沒有Ty-2和/或Ty-3基因。

2、按權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于所述的育種分離世代材料為高度分離的F₂后代群體或者高度分離的BC₁后代群體。

3、按權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于所述改進(jìn)的CTAB法提取DNA為，配制CTAB緩沖液：100mL?1mol·L^-1Tris?pH?7.5，140mL?5mol·L^-1NaCl，20mL?0.5mol·L^-1EDTA?pH?8.0，740mL?MiliQ?H₂O，20g?CTAB；10mg的新鮮葉片放入研缽中，加入150μL?CTAB緩沖液，用缽杵輕輕研磨，然后再加入150μL?CTAB緩沖液混勻；65℃水浴40min；加入300μL?24∶1氯仿/異戊醇，上下混勻5min，使樣品與氯仿充分混和；13000r·min^-1離心5min；取上清液150μL，加入在-20℃預(yù)冷的異丙醇200μL，輕輕上下顛倒混勻；10000～12000r·min^-1離心3～4min，棄上清液；讓異丙醇揮發(fā)干凈，加入50～100μL含RNase的ddH₂O溶解DNA；然后用1％的瓊脂糖電泳檢測(cè)。

4、按權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記輔助選擇方法，其特征在于所述的雙重PCR反應(yīng)體系，其Mg²⁺濃度為2mmol·L^-1，引物濃度為0.625ng·μL^-1，退火溫度為54℃，循環(huán)數(shù)為40。