[發明專利]利用液氮預凍提高乳酸菌冷凍干燥后存活率的方法

無效

• 申請號: 200910096537.1
• 申請日: 2009-03-06
• 公開（公告）號: CN101503668A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 朱東升;何國慶;李青青
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/225;C12R1/23;C12R1/46
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及一種冷凍干燥的預凍方法，具體為一種提高乳酸菌冷凍干燥后存活率的預凍方法。

背景技術

隨著人們對生活質量要求的提高，凍干產品越來越受歡迎。但因目前國內真空冷凍干燥微生物的技術還不夠完善，凍干產品的活菌數還不夠高，冷凍干燥技術還處于發展階段。

直投式凍干發酵劑，活菌含量高，保藏和運輸方便，機械化程度高，便于工業化批量生產，是今后高效濃縮型發酵劑的主要發展方向。而制備直投式凍干發酵劑的主要方法是冷凍干燥，其基本原理是：菌體與保護介質混溶，在共溶點以下預凍，然后，在低于三相點壓力的高度真空狀態下，使菌品中的冰晶升華，除去菌品中的多余水分，獲得一定含水量的干燥發酵劑。這一過程中影響凍干發酵劑細胞存活率的因素很多，但其中的預凍過程是凍干發酵劑制備中十分重要的工藝環節。然而，微生物在冷凍過程中，不可避免地會造成部分細胞的死亡或損傷，尤其是乳酸菌，生理條件要求苛刻，細胞死亡率明顯升高。那么，怎樣降低預凍過程乳酸菌的死亡率是目前研究的重要環節

在真空冷凍干燥保藏菌種的過程中，凍結速度是影響微生物存活率的重要因素，不同微生物最佳冷凍速度不同，其主要原因是凍結速度必須與微生物細胞對水分的滲透率相平衡，而細胞對水分的滲透率取決于細胞表面積與體積的比率以及細胞膜的滲透率。當冷凍速度過慢時，細胞嚴重脫水，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時細胞將失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結冰，從而使細胞外未結冰的溶液中溶質濃度過高，產生溶質損害；當冷凍速度過快時，細胞內的水分來不及外滲，會形成較大冰晶，使細胞膜及細胞器遭到破壞，造成細胞內冰晶機械損傷。另也有研究報道，冷凍速度在5℃/min～180℃/min之間時，冷凍過程中胞內水分會完全滲出細胞，胞內不會出現結晶，細胞存活率較高；當冷凍速度大于5000℃/min時，胞內水分迅速形成結晶，不發生外滲，細胞存活率也比較高；但是如果冷凍速度在180℃/min～5000℃/min之間時，細胞內水分容易在外滲過程中形成結晶對細胞造成機械損傷。

發明內容

本發明提供一種利用液氮進行預凍從而提高乳酸菌冷凍干燥后的存活率的方法。

該方法包括如下步驟：

(1)把培養好的乳酸菌進行菌泥的收集，并加入保護劑；

菌泥的收集中離心機械作用力以及時間和溫度對凍干后存活率都有一定影響，本發明采用速度為4000-6000rpm，時間為10-20min，溫度為4℃的條件離心，使離心損失率最小。

(2)將菌泥滴入液氮中進行預凍；增大菌泥與液氮接觸的表面積(比如采用不同規格的移液槍將菌泥滴入液氮)，可以增加冷凍干燥后乳酸菌的存活率；

(3)將預凍后的菌泥放入冷凍干燥儀內冷凍干燥，省去儀器原有的預凍階段；

(4)收集產品，進行真空保存。

不同的乳酸菌可以選擇添加不同的保護劑，本發明按照常規操作選擇保護劑即可，菌泥與保護劑的質量比為0.5-2∶1。

但是，各類保護劑各有優缺點，單一保護劑不能滿足菌體抵抗外界惡劣條件的要求，例如大分子保護劑的物理化學特性目前還不清楚，但它主要是保護細胞的表面免受傷害，凍干過程中對細胞有一定的保護作用，但大分子保護劑單獨使用時，在保存期間對細胞的保護效果卻不明顯。如果合適的大分子和小分子保護劑配合使用，將會加速干燥且能在干燥和保存期間維持較高的細胞存活率。以一定比例復配的保護劑效果較好，其中以脫脂乳、海藻糖、維生素C和谷氨酸鈉復配后的保護效果最好。這四者具有互補作用，脫脂乳主要在細胞表面起保護層作用；維生素C和谷氨酸鈉能滲透到細胞內部；在干燥過程中海藻糖糖形成一種玻璃態，在玻璃態下黏度極高，因而分子擴散系數很低，使大分子物質的鏈鍛運動受阻，細胞壁的通透性降低.從而起到保護作用。

選定嗜酸乳桿菌為實驗對象，通過對脫脂乳、海藻糖、維生素C和谷氨酸鈉進行正交實驗，確定最好的復配比例。

注：(1)K1為水平1的結果之和的平均數，K2為水平2的結果之和的平均數，K3為水平3的結果之和的平均數(2)R為極差

通過優化凍干保護劑的正交試驗結果，最佳凍干保護劑配方為：脫脂乳∶海藻糖∶維生素C∶谷氨酸鈉(質量比)＝15∶4∶1∶1.5，此保護劑對于選定的嗜酸乳桿菌的凍干存活率達到89.10％。

步驟(2)中液氮預凍的時間為1-2h。