[發(fā)明專利]狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910096309.4
• 申請日: 2009-02-19
• 公開（公告）號: CN101566630A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳常文;于新秀;徐佳晶
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海洋學(xué)院
• 主分類號: G01N33/552
• 分類號: G01N33/552;G01N33/533
• 代理公司: 寧波奧凱專利事務(wù)所
• 代理人: 白洪長

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動物疾病的預(yù)警方法，尤其涉及狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法。

背景技術(shù)

狀黃姑魚(Nibea?miichthioides?Chu?Lo&Wu)隸屬于石首魚科黃姑魚屬，閩、粵沿海漁民俗稱鱸，體重可達(dá)25至30kg，肉味鮮美，魚鰾還具有藥用價值，暢銷于國際市場。狀黃姑魚主要采用的是海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的方法，狀黃姑魚雖然抗病能力較強，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，其發(fā)生疾病的問題也日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟損失。有效地防治細(xì)菌性魚病是提高生產(chǎn)經(jīng)營效益的必要措施。

細(xì)菌性魚病對魚類養(yǎng)殖業(yè)危害廣，威脅嚴(yán)重。由于魚類生活在水中，直觀性不及陸上動物；水又是很好的媒介體，病菌的傳染較空氣中更為容易，因此預(yù)防工作十分重要，尤其是監(jiān)測健康魚及病菌攜帶者，是有效防治魚病的關(guān)鍵。狀黃姑魚的細(xì)菌性爛鰓病的病原為桿狀細(xì)菌，主要表現(xiàn)癥狀為病魚體色發(fā)黑，游動緩慢，外界刺激反應(yīng)遲鈍，食欲減退，魚體消瘦。捕起病魚觀察，可見病魚鰓蓋內(nèi)表皮膚充血發(fā)炎，鰓絲粘液增多、腫脹，部分呈淡紅色，淤血處呈紫紅色，并可見小出血點。池水溫達(dá)到25至30℃時，易發(fā)生此病，各生長階段魚均有發(fā)生，發(fā)病率約5％至10％。迅速、準(zhǔn)確地診斷該魚病，檢測出細(xì)菌病原，是有效防治的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人工養(yǎng)殖狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病發(fā)生的預(yù)警方法，達(dá)到提前預(yù)知，及時采取必要手段進行預(yù)防和處理以達(dá)到避免重大經(jīng)濟損失的目的。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，其具有以下步驟：

①制備熒光抗體：取患病魚的血清加入佐劑，注射到體重為2kg至3kg的兔體內(nèi)，制備兔抗魚血清抗體，并用熒光色素對抗體進行標(biāo)記，得到標(biāo)記溶液待用；

②純化熒光抗體：首先將步驟①的標(biāo)記溶液用透析法除去該標(biāo)記溶液中游離的熒光素，再采用纖維素過柱法除去過度標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子，將純化產(chǎn)物冷凍保存；

③檢測：選取待測標(biāo)的物，并將待測標(biāo)的物鋪設(shè)載玻片表面固定；將上述固定有待測標(biāo)的物的載玻片上滴加步驟②純化產(chǎn)物。

為優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的措施還包括：待測標(biāo)的物為狀黃姑魚的血清液或體表粘液或鰓絲片段。

佐劑的成分按照體積份數(shù)含有羊毛脂1份、石臘油2份至9份。

佐劑的混勻為乳濁液，并經(jīng)高溫滅菌；佐劑還含有3mg/ml至4mg/ml的卡介苗。

在步驟①中，熒光色素為異硫氰酸熒光素；標(biāo)記的步驟包括：用pH9.5碳酸鹽緩沖液將純抗體液稀釋至20mg/ml，得到蛋白液；再按質(zhì)量份數(shù)異硫氰酸熒光素1分、抗體20份至100份稱取異硫氰酸熒光素，并用pH9.5碳酸鹽緩沖液溶解，得到熒光素液；然后，混合蛋白液和熒光素液，用碳酸鈉溶液調(diào)整pH，使蛋白液和熒光素液的混合液的pH大于或等于9。

在步驟②中，透析法的透析液采用0.01Mol/L?pH7.6?PBS或生理鹽水；透析的溫度為3℃至5℃；透析的時間為4天至7天。

在步驟②中，纖維素過柱法采用磷酸鹽緩沖液(PBS)液階梯洗脫，洗脫階梯數(shù)至少為4個。

磷酸鹽緩沖液(PBS)液還含有0.05Mol/L至0.2Mol/L的NaCl。

在步驟③中，固定的步驟為：將鋪設(shè)有待測標(biāo)的物載玻片在火焰上通過3次；再放在密閉濕盒中，37℃恒溫30分鐘；然后用0.1Mol/L、pH為8的磷酸鹽緩沖液(PBS)，最后冷風(fēng)吹干。

本發(fā)明的優(yōu)點是通過熒光抗體的制備和純化可到大量的免疫熒光探針分子，成本低廉，采用本發(fā)明的免疫熒光的檢測方法不僅能快速檢測病原，檢測的時間一般不超過3h，為疾病的及時預(yù)警和防治贏得了寶貴的時間，而且該方法還能夠檢測到帶菌狀態(tài)或未發(fā)病的被感染個體，在實踐中此類潛伏狀態(tài)更加具有風(fēng)險。攜帶病原的魚由于個體免疫性狀的差異性，如果其自身免疫力超出一般水平則可能終生不發(fā)病，然而其具有傳播病原的風(fēng)險。在免疫能力一般的魚接觸病原后，經(jīng)短時期的潛伏就會大規(guī)模爆發(fā)，造成慘重的經(jīng)濟損失。因此，定期采用本發(fā)明的方法檢測可能具有細(xì)菌性爛鰓病病原的待測標(biāo)的物，以及時采取規(guī)避手段，在較低成本的前提下能夠極大幫助養(yǎng)殖戶降低養(yǎng)殖風(fēng)險。而且，在制得免疫熒光探針分子后保存條件比較普通，檢測的操作也很方便，為本發(fā)明方法大量的推廣使用創(chuàng)造了有利條件。

具體實施方式

以下結(jié)合附實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。

實施例：

狀黃姑魚細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)警方法，具有以下步驟：