[發明專利]O157:H7大腸菌的環介導等溫擴增快速檢測試劑盒及方法

無效

• 申請號: 200910096030.6
• 申請日: 2009-01-23
• 公開（公告）號: CN101487057A
• 公開（公告）日: 2009-07-22
• 發明（設計）人: 朱水榮
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及O157:H7大腸菌的環介導等溫擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。?

(二)背景技術

新發現和重新抬頭的病原微生物是當前世界醫學面臨的新課題，腸出血性大腸菌O157:H7就是其中的一種。O157:H7是腸出血性大腸艾希菌(Enterohemorrhagic?Escherichia?coli，EHEC)最主要的血清型，于1982年首次在美國發現，為新發病原菌。其致病性強，感染劑量極低，食入不足10個細菌即可引起疾病。該菌主要引起出血性腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合癥(HCS)和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，病死率高達30％以上，是全球關注的世界性公共衛生問題。我國自1988年在江蘇徐州檢出首株EHEC?O157:H7后，各地加強了對腸道門診、畜禽及肉制品等的食品檢測，相繼從腹瀉病人、家畜、家禽及食品中多次檢出O157:H7大腸菌。通過對近幾年我省O157分離株毒力基因檢測(PCR法)發現我省主要以Stx2為主，同時攜帶Stx2和Stx1基因的菌株則比較少，這與國內其他省市分離出的大多數菌株相似，但與Fagan等報道則不同，故本研究主要選取stx2基因為靶基因進行檢測。rfbE與fliC基因分別編碼O157:H7菌體抗原O抗原及鞭毛抗原H抗原，針對這兩種基因的檢測將有助于O157:H7血清型診斷的進一步驗證。?

目前，大多數基層實驗室鑒定O157:H7大腸菌仍主要依賴于傳統培養方法、生化和血清學鑒定方法，檢驗方法繁瑣，費時費力，報告檢驗結?果時間長，難以適應快速檢測的要求。近年來，PCR法檢測O157:H7大腸菌得到了迅速發展，主要有常規PCR、多重PCR、Real-time?PCR等，但這些方法均需特殊的儀器，不適合在基層或小型實驗室推廣使用。Notomi等是2000年開發出的一種新的DNA環介導恒溫擴增法(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)，因其具有操作簡便易行、結果判讀簡單等特點，可以在基層實驗室推廣使用，該方法已在一些國家地區被廣泛應用，而國內對此技術研究則剛剛起步，應用LAMP技術檢測O157:H7大腸菌目前未見文獻報道。?

環介導等溫擴增技術原理：環介導等溫擴增(loop-mediated?isothermalamplification，LAMP)技術是Notomi等2000年開發出的一種新的DNA環介導的恒溫擴增法，即利用Bst大片段DNA聚合酶和根據不同靶序列設計的4-6條引物，特異地識別靶序列上的6個特定區域，在60～65℃等溫條件下高效特異地擴增目的靶基因，終產物是具有與目的靶基因反相重復序列的莖環DNA。如果再設計1-2條環引物，則可大大提高擴增反應速度。該方法的一大特點是，可以通過反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀的產生與否判斷靶基因的存在，抑或在體系中加入熒光染色試劑，在紫外燈下觀察，對反應產物實時監測。?

(三)發明內容

本發明就是根據上述原理，針對O157:H7的O抗原編碼rfbE、志賀樣毒素stx2、H鞭毛抗原編碼flic基因分別設計LAMP引物，提供一種特異性強、靈敏度高的O157:H7大腸菌的環介導等溫擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。?

本發明采用的技術方案是：?

O157:H7大腸菌的環介導等溫擴增快速檢測試劑盒，主要包括特異?性擴增引物、Bst?DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸混合物、PCR緩沖液，所述特異性擴增引物序列如下：?

rfbE?FIP(O抗原編碼rfbE特異性擴增內引物FIP)：?

CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT；?

rfbE?BIP(O抗原編碼rfbE特異性擴增內引物BIP)：?

TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；?

rfbE?F3(O抗原編碼rfbE特異性擴增外引物F3)：?

AACAGTCTTGTACAAGTCCA；?

rfbE?B3(O抗原編碼rfbE特異性擴增外引物B3)：?

GGTGCTTTTGATATTTTTCCG；?

rfbE?LB(O抗原編碼rfbE特異性擴增環引物LB)：?

CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC；?

stx2FIP(志賀樣毒素stx2特異性擴增內引物FIP)：?

GGTTAATAACAGACACCGATGTGG-ACAGAGATATCGACCCCT；?