[發(fā)明專利]野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的制備方法及其用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910095343.X
• 申請日: 2009-01-08
• 公開（公告）號: CN101487014A
• 公開（公告）日: 2009-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張傳溪;郎國竣
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/85;C12N9/16;G01N21/78;C12Q1/46
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 金 祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及鱗翅目1型乙酰膽堿酯酶基因在昆蟲細胞中的表達，以及表達產(chǎn)物的純化及在農(nóng)藥篩選和檢測中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

乙酰膽堿酯酶(AChE；EC?3.1.1.7)能催化神經(jīng)傳遞物質(zhì)乙酰膽堿的水解反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸間隙的乙酰膽堿水平和終止神經(jīng)沖動傳遞，是動物神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一[Taylor?P.The?pharmacological?basis?of?therapeutics，8th?ed.New?York：MacMillan；1990]。它由乙酰膽堿酯酶基因(ace)編碼，是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用分子靶標(biāo)。自從第一個乙酰膽堿酯酶基因從果蠅(Drosophila?melanogaster)中克隆出來后[Hall?LM，Spierer?P.The?Ace?locus?of?Drosophila?melanogaster：structural?genefor?acetylcholinesterase?with?an?unusual?5’leader，EMBO?J.1986；5：2949-2954]，多種昆蟲的乙酰膽堿酯酶基因也相繼被報道。近年來發(fā)現(xiàn)，果蠅和家蠅只有一種乙酰膽堿酯酶基因，而許多昆蟲都有兩種類型的乙酰膽堿酯酶基因；其中一種與果蠅和家蠅的乙酰膽堿酯酶基因序列很相似，現(xiàn)被稱為“2型乙酰膽堿酯酶基因(ace2)”，而另一種乙酰膽堿酯酶基因與果蠅和家蠅的乙酰膽堿酯酶基因序列差異很大，這兩種乙酰膽堿酯酶氨基酸序列同源性在40％以下，其被稱為“1型乙酰膽堿酯酶基因(ace1)”。鱗翅目昆蟲中包括棉鈴蟲Helicoverpa?armigera[Brun-Barale?GenBank?AAY59530]、煙芽夜蛾H.assulta[Lee?DW，Kim?SS，Shin?SW，Kim?WT，Boo?KS.Biochim?Biophys?Acta.2006；1760：125-33.]小菜蛾P(guān)lutella?xylostella(Baek?et?al，2005.Pesticide?Biochemistry?andPhysiology?81：164-175)、蘋果蠹蛾Cydia?pomonella[Cassanelli，S.，Reyes，M.，Rault，M.，Manicardi，G.C.and?Sauphanor，B.2006?Insect?Biochem.Mol.Biol.36(8)，642-653]、家蠶Bombyx?mori[Shang?JY，Shao?YM，Lang?GJ，Zhang?CX，Yuan?G，TangZH.2007.Insect?Science，6：443-449.]等也先后報道是兩種乙酰膽堿酯酶基因。鱗翅目昆蟲是最大的害蟲類群，而1型乙酰膽堿酯酶基因在兩種類型乙酰膽堿酯酶基因中是占優(yōu)勢基因，其1型乙酰膽堿酯酶在農(nóng)藥分子設(shè)計、新農(nóng)藥品種和新農(nóng)藥混劑開發(fā)的體外?有效性篩選及農(nóng)藥殘留檢測方面具有很大的應(yīng)用價值和市場需求。但是用鱗翅目昆蟲頭部乙酰膽堿酯酶費錢費力。?

因此，利用基因工程手段生產(chǎn)具有高度生物學(xué)活性的鱗翅目的1型AChE是許多工作努力要實現(xiàn)的目標(biāo)。但要表達生產(chǎn)出具有高活性純的鱗翅目的AChE并不容易、除我們曾嘗試表達家蠶的AChE外，還沒有其它相關(guān)成功報道。但我們表達的家蠶的AChE存在酶活性太低，在農(nóng)藥分子設(shè)計、新農(nóng)藥品種和新農(nóng)藥混劑開發(fā)的體外有效性篩選及農(nóng)藥殘留檢測方面還無法使用的缺陷。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種制備野蠶(鱗翅目)1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的方法，采用該方法能制備高活性的鱗翅目1型乙酰膽堿酯酶，并能將其用于新農(nóng)藥品種和新農(nóng)藥混劑開發(fā)的體外有效性篩選及農(nóng)藥殘留檢測等方面。?

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種野蠶1型乙酰膽堿酯酶活性蛋白的制備方法，包括以下步驟：?

1)、將編碼具有野蠶1型乙酰膽堿酯酶(去除32個C端氨基酸殘基)基因的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成分泌非融合蛋白的野蠶(鱗翅目)1型乙酰膽堿酯酶表達pFastBac系列載體；?

2)、將上述步驟所得的表達載體轉(zhuǎn)入宿主昆蟲細胞，形成野蠶1型乙酰膽堿酯酶的重組細胞；?

3)、在適合分泌表達野蠶1型乙酰膽堿酯酶多肽的條件下，培養(yǎng)上述步驟的重組細胞；?

4)、用procainamide親和層析柱分離出具有野蠶1型乙酰膽堿酯酶蛋白活性的多肽。?