[發(fā)明專利]赤羽病競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910094815.X
• 申請日: 2009-08-07
• 公開（公告）號: CN101625362A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 花群義;阮周曦;詹愛軍;楊俊興;林慶燕;宗卉;曾少靈;曹琛福;秦智鋒;呂建強
• 申請（專利權(quán)）人: 花群義
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 云南派特律師事務(wù)所
• 代理人: 張 怡

1、一種赤羽病競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，其特征在于是由以下組分分裝后組成：AKV抗原包被ELISA板、羊抗鼠IgG-HRP酶結(jié)合物、單克隆抗體、陽性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、10倍濃縮稀釋液、底物I、底物II、底物III、終止液，所述的羊抗鼠IgG-HRP酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體IgG；所述的單克隆抗體為鼠抗赤羽病病毒的特異性單克隆抗體McAb；所述的20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05％Tween-20的0.01mol/LpH7.4PBS；所述的10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1％明膠的PBST；所述的底物I為pH6.0的乙酸-檸檬酸緩沖液；所述的底物II為3.3’-5.5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液；所述的底物III為雙氧水溶液；所述的終止液為1mol/L?H₂SO₄硫酸溶液。

2、如權(quán)利要求1所述的赤羽病競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，其特征在于其各組分的數(shù)量為：

AKV抗原包被ELISA板????????2板96孔酶標板

羊抗鼠IgG-HRP酶結(jié)合物?????0.5ml

單克隆抗體????????????????0.5ml

陽性血清??????????????????1ml

陰性血清??????????????????1ml

20倍濃縮洗滌液????????????50ml

10倍濃縮稀釋液????????????30ml

底物I?????????????????????20ml

底物II????????????????????2ml

底物III???????????????????1ml

終止液????????????????????20ml。

3、如權(quán)利要求1和2任意一項所述的赤羽病競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒的制備方法，其特征在于由以下步驟組成：

一、赤羽病病毒ELISA包被抗原的制備：BHK-21細胞長成單層后接種AKV，無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，3～4d后細胞病變達75％以上時，收獲病毒，反復(fù)凍融3次，以8000r/min離心30min，取上清液，加入終濃度為1/3000的甲醛滅活病毒。采用20％、60％(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度20000r/min?4℃超速離心3h，收獲提純的病毒條帶作為AKV抗原；

二、AKV抗原包被ELISA板的制備：將純化后的AKV抗原，用包被緩沖液稀釋成4.0μg/mL，以50μL/孔包被ELISA板；以200μL/孔加入封閉液封閉，所述的封閉液為含1％BSA、2％明膠、0.01％硫柳汞的0.01mol/L?pH7.2磷酸鹽緩沖液；

三、羊抗鼠IgG-HRP酶結(jié)合物的制備：利用常規(guī)方法從健康的BALB/c小鼠血清中提取IgG，與等體積弗氏完全佐劑乳化，充分混勻后經(jīng)背部皮下注射健康的18個月以上的山羊，2mL/只；首免后第2周和第4周分別用相同劑量加等體積弗氏不完全佐劑FIA進行二免和三免后，無菌采血分離血清，分別經(jīng)1次50％和2次33％飽和硫酸銨沉淀提純羊抗鼠IgG，透析除鹽；用改良的過碘酸氧化法將辣根過氧化物酶HRP標記于羊抗鼠IgG，1mL/管分裝，-80℃保存；

四、單克隆抗體的制備：用提純的赤羽病病毒抗原分別加等體積弗氏完全佐劑乳化和弗氏不完全佐劑乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50％聚乙二醇MW4000融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗AKV的陽性孔，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗AKV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，利用BALB/c小鼠制備抗赤羽病病毒單克隆抗體腹水；

五、陽性血清的制備：挑選體格健壯的18個月以上的山羊2～3只，將純化后AKV與等體積弗氏完全佐劑乳化，充分混勻后經(jīng)背部皮下注射，2mL/只；首免后第2周和第4周分別用AKV相同劑量加等體積弗氏不完全佐劑FIA進行二免和三免后，無菌采血分離血清；用血清保存液配方I按1∶2稀釋，1mL/管分裝，-80℃保存；

六、陰性血清的制備：選擇體格健壯的18個月以上的山羊，采血檢測確認無赤羽病的抗體，無菌采血分離血清，用血清保存液配方I按1∶2稀釋，1mL/管分裝，-80℃保存；

七、20倍濃縮洗滌液、10倍濃縮稀釋液、底物I、底物II、底物III、終止液的優(yōu)選：通過試驗選定20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05％Tween-20的0.01mol/L?pH7.4PBS；10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1％明膠的PBST；底物I為pH6.0的乙酸-檸檬酸緩沖液；底物II為3.3’-5.5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液；底物III為雙氧水溶液；終止液為1mol/L?H₂SO₄硫酸溶液；

八、試劑盒的組裝：將按上述方法制備好的ELISA抗原包被板封閉于鋁簿/簿錫紙中，內(nèi)置2g硅膠干燥劑，封口，羊抗鼠IgG-HRP酶結(jié)合物、單克隆抗體、10倍濃縮稀釋液、20倍濃縮洗滌液、底物液I、底物液II、底物液III、終止液、陽性血清、陰性血清定量分裝，分別貼上標簽與說明，裝入專用的試劑盒外殼內(nèi)，外殼上貼上試劑盒標簽。