[發明專利]擬南芥谷胱苷肽依賴型甲醛脫氫酶基因的植物表達載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 200910094590.8
• 申請日: 2009-06-16
• 公開（公告）號: CN101570761A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 陳麗梅;宋中邦;李昆志;馬莉;胡清泉;陳紅梅
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 賽曉剛

1.構建擬南芥谷胱苷肽依賴型甲醛脫氫酶基因的植物表達載體pH2-35S-PrbcS-adh的方法，所述的載體含有谷胱苷肽依賴型甲醛脫氫酶基因adh?cDNA，谷胱苷肽依賴型甲醛脫氫酶基因adh的cDNA來源于擬南芥，GenBank登錄號為834417，上游連接有Rubisco?3C小亞基的光誘導型啟動子PrbcS，用于構建所屬植物表達載體的起始載體為pH2GW7；該方法包括下述步驟：

(1)從GenBank中查找擬南芥adh基因的cDNA序列，并設計序列如下的一對引物：

5’adh：CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC

3’adh：GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG

上游引物5’adh，5’端加CACC特征序列，并由此形成Nco?I酶切位點；下游引物3’adh，末端加EcoRI酶切位，以擬南芥第一鏈cDNA為模版擴增，得到adh基因的全長cDNA；

(2)回收并純化adh全長基因cDNA片段，并將其連接到pMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD-adh；

(3)構建中間載體pENTR^TM2B-adh，用SalI和EcoR?I酶切pMD18-adh和pENTR^TM2B(Invitrogen)得到目的基因片段adh和載體片段pENTR^TM，回收后進行連接、轉化感受態細胞，得到重組載體pENTR^TM-adh；

(4)構建入門載體pENTR*-PrbcS-adh，用Nco?I和EcoR?I消化pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pENTR^TM-adh，回收載體pENTR*-PrbcS片段和adh基因cDNA片段，然后連接、轉化、抽提質粒進行PCR檢測和酶切檢測，獲得重組質粒pENTR*-PrbcS-adh；

(5)構建植物表達載體pH2-35S-PrbcS-adh，通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-adh亞克隆到植物表達載體pH2GW7中，獲得adh基因的植物表達載體pH2-35S-PrbcS-adh。