[發(fā)明專利]一種在滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增強紫草素合成的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910094230.8
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101503715A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葛鋒;劉暢;陳朝銀;劉迪秋
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號: C12P7/26
• 分類號: C12P7/26
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 金耀生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過添加多聚物來促進滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增強紫草素合成的方法。

背景技術(shù)

滇紫草(Onosma?paniculatum?Bur.et?Fr.)主產(chǎn)云南，是云南省本地常用中草藥，屬紫草科(Boraginaceae)植物，其根藥用。主要有效成分為紫草素及其衍生物，這些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，而且還作為天然色素廣泛用于醫(yī)藥、化妝品和印染工業(yè)。目前，滇紫草的野生資源破壞嚴(yán)重，市場上供需矛盾凸顯。而利用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)在反應(yīng)器中直接培養(yǎng)細(xì)胞獲得藥用次生代謝產(chǎn)物是將來生產(chǎn)植物藥最直接、最有效的手段。而對于開展細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物，獲得一種能顯著促進次生代謝物合成的方法，是保證高生產(chǎn)效率，縮短生長周期，降低生產(chǎn)成本的有效手段。

隨著植物細(xì)胞離體培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進和革新，發(fā)現(xiàn)了越來越多的生物或非生物的脅迫因子對植物次生代謝過程產(chǎn)生影響，而這些影響結(jié)果有不是積極的，是與培養(yǎng)目標(biāo)相一致的。紫草素作為典型的植物次生代謝產(chǎn)物，已有報道表明多種物質(zhì)能提高滇紫草培養(yǎng)細(xì)胞中紫草素含量，如某些真菌提取物可以提高滇紫草培養(yǎng)過程中的紫草素含量一倍左右(寧文等，植物生理學(xué)報，1994，20(4)：325-331)；油菜素內(nèi)酯添加到培養(yǎng)基，可以提高滇紫草細(xì)胞紫草素含量70％以上(張華等，南京大學(xué)學(xué)報，1999，35(2)：151-155.)；甲基茉莉酮酸酯配合植物激素作用，可以顯著提高細(xì)胞中紫草素的合成量(Ding?et?al.In?VitroCell?Dev-PL，2004，40：581-585)。綜合上述，發(fā)現(xiàn)更多、更有效的刺激因子來高植物藥用次生代謝產(chǎn)物的含量是行之有效的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種通過添加多聚物—殼聚糖來促進滇紫草細(xì)胞培養(yǎng)過程中增強紫草素合成的方法。

該方法的操作步驟如下：

1)滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)：繼代培養(yǎng)基為：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25±1℃，避光培養(yǎng)；

2)合成培養(yǎng)基的配制及紫草素合成階段的細(xì)胞培養(yǎng)：M10固體培養(yǎng)基+殼聚糖，殼聚糖加入量為每升M10培養(yǎng)基5-50mg，M10培養(yǎng)基的成分如表1所示；殼聚糖的種類為分子量60000的殼聚糖、分子量90000的殼聚糖、分子量400000的殼聚糖中的一種。在裝有40mL固體培養(yǎng)基的三角瓶中進行，采用繼代培養(yǎng)15天的細(xì)胞接種，培養(yǎng)溫度為25±1℃，pH值5.6，暗培養(yǎng)，該紫草素合成階段的細(xì)胞培養(yǎng)周期為15天。

表1??M10培養(yǎng)基成分

3)紫草素含量的測定：將培養(yǎng)的滇紫草細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入一定量的石油醚(沸點30—60℃)，用超聲細(xì)胞破碎儀進行細(xì)胞破碎，然后在室溫下振蕩(110r/min)提取24h，提取液用于測定細(xì)胞中紫草素的含量。

紫草素呈紅棕色，用分光光度計測量，在520nm處有最大吸收峰。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到C＝187.85X—2.09，r＝0.9995，其中C為石油醚溶液中的紫草素濃度(mg/L)，X為該測定溶液的吸光度值。

S＝(CNV/W)×100％；

其中，S為紫草素含量(％)，W為愈傷組織干重(mg)，V為萃取液體積(L)，N為稀釋倍數(shù)。

本發(fā)明的關(guān)鍵點在于：1.所添加殼聚糖的分子量；2.添加殼聚糖的濃度。以上關(guān)鍵點如能把握好，可以顯著提高細(xì)胞紫草素的含量。

本發(fā)明操作簡便，效果良好，本發(fā)明可應(yīng)用到植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的實際生產(chǎn)過程中。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

1)滇紫草細(xì)胞的繼代培養(yǎng)：繼代培養(yǎng)基為：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25±1℃，避光培養(yǎng)；

2)將繼代培養(yǎng)15天的滇紫草細(xì)胞接種在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為：M10固體培養(yǎng)基+分子量為60000的殼聚糖(用量見表2)，pH值5.6，培養(yǎng)溫度為25±1℃，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為15天。

3)培養(yǎng)結(jié)束后測定細(xì)胞紫草素的含量，其結(jié)果見表2。

表2??不同濃度的殼聚糖(分子量60000)對滇紫草細(xì)胞紫草素含量的影響

注：對照組為不添加殼聚糖的實驗組。

實施例2：