[發明專利]一種與草甘膦抗性相關的Ⅱ型EPSP合酶保守模體無效

申請號：	200910093527.2	申請日：	2009-10-12
公開（公告）號：	CN101691563A	公開（公告）日：	2010-04-07
發明（設計）人：	林敏;李亮;陸偉;張維;陳明;平淑珍;燕永亮	申請（專利權）人：	中國農業科學院生物技術研究所
主分類號：	C12N9/10	分類號：	C12N9/10;C12N15/82;C12Q1/48;C12N15/63
代理公司：	北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129	代理人：	張濤
地址：	100085 北***	國省代碼：	北京;11
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	一種草甘膦抗性相關 epsp 保守
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種II型EPSP合酶的序列模體。

背景技術

EPSP合酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，EC2.5.1.19)作為莽草酸合成途徑的第六位酶，是除草劑草甘膦作用的靶標酶，對植物、真菌、細菌和部分病原寄生蟲合成芳香族氨基酸及其它芳香族代謝產物必不可少的。由于哺乳動物體內不存在莽草酸途徑，因此EPSP合酶成為研發新型除草劑和新型抗菌素等的靶標酶。

EPSP合酶分I型和II型兩種類型，其中II型EPSP合酶通常都源于草甘膦耐受的微生物，有較高的底物PEP親和性和催化效率。如源自根癌膿桿菌CP4的EPSP合酶，不受草甘膦抑制并且為耐受草甘膦轉基因作物提供了一個新的作用模式。

如果能發現II型EPSP合酶的高度保守序列模體，可以為研發新型抗草甘膦植物、研發新型除草劑和新型抗菌素等提供方便的手段。已有人做了此方面的工作，如Monsanto公司利用定點突變方法對CP4?EPSP合酶與草甘膦抗性相關的模體進行了研究，發現了Arg-X-His-X-Glu、Gly-Asp-Lys-X、S-A-Q-X-K和Asn-X-Thr-Arg四個序列模體在II型酶中高度保守，通過替換X位點氨基酸會極大影響該型酶對草甘膦的抗性。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的II型EPSP合酶序列模體。

本發明在II型EPSP合酶中發現了一個新的高度保守的序列模體(sequence?motif)，其氨基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X選自以下氨基酸中任意一種：Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp或Glu。

實驗證實，除X外，所述序列模體中其它四個氨基酸對酶活力至關重要?？勺鳛榛衔锕舻陌形稽c，為抗菌新藥物的合成奠定基礎；

所述序列模體中，X是不保守位點氨基酸，實驗證實，用不同的氨基酸替換后可提高或降低除草劑草甘膦的抗性。為II型EPSP合酶應用于抗除草劑草甘膦提供新的改造位點。

如本發明使用A1501EPSP合酶作為研究實例，其X位點Asn替換為Ser等氨基酸可提高除草劑草甘膦抗性，替換為Trp后對草甘膦抗性減弱。

為證實本發明的效果，進行了如下實驗：

1、II型EPSP合酶多序列比對

所有II型EPSP合酶氨基酸序列比對后，發現了新的序列模體Arg-Pro-Met-X-Arg。(見實施例1)此模體存在于已知的所有II型EPSP合酶中，其中Arg、Pro、Met、Arg四個氨基酸在所有II型EPSP合酶序列中完全保守。X位點可為二十種氨基酸替換。

2、保守位點氨基酸的替換

新序列模體中四個保守的氨基酸進行任意氨基酸替換，酶功能互補試驗結果顯示均失去酶活力。(見實施例2)

3、非保守位點氨基酸替換

非保守位點氨基酸替換后，酶功能互補試驗結果顯示功能可互補。(見實施例3)

4、草甘膦抗性測定

將X位點逐個進行草甘膦抗性測定，結果顯示此位點的替換可提高或降低酶對除草劑草甘膦的抗性。(見實施例4)