[發明專利]定量檢測人血清中自體α-突觸核蛋白抗體的方法

有效

• 申請號: 200910093266.4
• 申請日: 2009-09-24
• 公開（公告）號: CN101692092A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 陳彪;徐勝利
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學宣武醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/52;G01N33/531;C12N15/70;C12P21/02;C07K16/18;C07K1/30;C12R1/19
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所 11130
• 代理人: 王為

技術領域：

本發明涉及一種人血清中自體α-突觸核蛋白抗體的檢測方法，該方法可用于帕金 森病的診斷。

背景技術：

帕金森病(Parkinsonps?disease，PD)是一種發病率僅次于老年癡呆的老年神經退 行性疾病，其主要病理特征以中腦黑質致密部多巴胺能神經元進行性丟失和殘留 神經元胞漿內出現嗜酸性包涵體，稱路易小體。α-突觸核蛋白是構成路易小體的主 要成分，主要以聚集體的形式存在。在帕金森病的發病過程中，高水平的α-突觸 核蛋白可形成對多巴胺能神經元具有毒性的變構形式，而這種變構形式有可能在 多巴胺能神經元死亡的局部微環境形成可導致自體抗體產生，進而在帕金森病人 的血清中出現自體α-突觸核蛋白抗體水平增高。到目前為止，只有一篇文獻報道 了在希臘的家族性帕金森病人血清中自體α-突觸核蛋白抗體水平增高，而且存在 著病例少和定量方法不完善等缺陷。目前，帕金森病的診斷主要依靠運動癥狀和 醫生的經驗，有較高的誤診率。臨床病理研究表明，在散發性帕金森病的診斷中， 至少有24％的誤診率。此外，由于帕金森病患者黑質多巴胺能神經元死亡特征表 現為進行性死亡，只有當黑質多巴胺能神經元死亡達到了70％左右時，才開始出現 運動癥狀，而這時已經是黑質多巴胺能神經元死亡的晚期。此時除了補充多巴胺 的對癥療法外，并無根治療法，勢必嚴重影響病人的生活質量和給社會和家庭增 加沉重的負擔。因此早期發現、診斷帕金森病對于及時治療、保護多巴胺能神經 元、延緩病情、改善患者的生活質量具有十分重要的意義。

本發明研究出檢測人血清中自體α-突觸核蛋白抗體的方法，可用于對帕金森病的 診斷，是篩選帕金森病高危人群和臨床診斷帕金森病的重要手段。

發明內容：

本發明提供一種帕金森病的診斷方法，其中包括人血清中自體α-突觸核蛋白抗體 的檢測方法。

本發明用抗原(重組人α-突觸核蛋白)和抗體(兔抗人α-突觸核蛋白多克隆抗 體)制備成試劑盒，用抗原抗體反應原理檢測帕金森病人和正常健康人血清中的 自體α-突觸核蛋白抗體的存在數量并進行比較，試劑盒采用顯色反應來判斷人血 清中的自體α-突觸核蛋白抗體的存在與否和數量多少。

本發明的帕金森病的診斷方法包括以下步驟：

步驟1、人α-突觸核蛋白的制備

步驟2、抗α-突觸核蛋白多克隆抗體的制備

步驟3、帕金森病人和正常健康人血清的制備

步驟4、人血清中自體α-突觸核蛋白抗體的檢測

步驟5、比較檢測結果

本發明的疾病診斷方法包括使用診斷試劑對人血清中自體α-突觸核蛋白抗體進 行檢測。

因此本發明包括診斷試劑盒。

本發明的診斷試劑盒的組成包括：

抗原(重組人α-突觸核蛋白)

抗體(兔抗人α-突觸核蛋白多克隆抗體)

本發明的試劑盒還包括以下輔助組成成分用于抗原抗體的反應測定。

抗原稀釋液(0.05M碳酸緩沖液，pH?9.6)

抗體與血清稀釋液(10％BSA/PBS)

洗板液(0.1％(v/v)Tween-20/PBS)

封閉液(10％BSA/PBS)

標記二抗(AP-山羊抗兔IgG；AP-山羊抗人IgG)

顯色底物(p-Nitrophenyl?Phosphate?Liquid?Substrate?System，Sigma)

96孔ELISA板。

本發明的試劑盒，各試劑分別包裝，優選使用包裝管，每個包裝管中裝入試劑的 量以夠-個樣本使用量為基本量，可以擴大到10個，100個，1000個樣本的使 用量。

本發明還包括的人血清中自體α-突觸核蛋白抗體的檢測方法，該方法包括以下步 驟：

抗原(重組人α-突觸核蛋白)和抗體(兔抗人α-突觸核蛋白多克隆抗體)進行 反應，根據反應顯色的差異判斷人血清中的自體α-突觸核蛋白抗體的存在與否和 數量多少。

采用本發明試劑盒進行檢測的方法如下：

1)包板：人α-突觸核蛋白(10μg/ml，碳酸緩沖液溶解)100μl/孔包被96孔 ELISA板，4℃，24小時。

2)洗板：用含0.1％(v/v)Tween-20的PBS(PBS-T)200μl/孔洗板3次，每次5 分鐘。