[發明專利]合浦珠母貝目的基因的定位方法

無效

• 申請號: 200910093208.1
• 申請日: 2009-09-15
• 公開（公告）號: CN102021227A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 謝莉萍;張榮慶;潘聰;黃晶;方東
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種對合浦珠母貝中的目的基因進行基因定位的方法。

背景技術

珍珠是一種典型的生物礦化產物，它不僅是裝飾品以及醫藥、化妝品的原材料，而且還是設計和制備新型仿生高性能工程材料的理想模板。因此研究珍珠礦化的分子機制具有重要的理論和實踐意義。

合浦珠母貝(Pinctada?fucata?Martenssi)，又稱馬氏珠母貝，屬于軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Bivalvia)，珍珠貝目(Pterioida)，珍珠貝科(Pteriidae)，珠母貝屬(Pinctada)，主要分布在我國和日本沿海，是目前世界上用于海水珍珠生產的主要貝類。

目前，對珍珠礦化機制的研究主要集中在參與礦化的蛋白或多肽的分離及其基因的克隆，有關基因的功能研究還存在諸多困難。研究功能基因的定位，將有助于揭示基因的功能，闡明珍珠質礦化的分子機制，從而為提高珍珠的產量與質量提供理論基礎。

發明內客

本發明的目的是提供一種對合浦珠母貝中的目的基因進行基因定位的方法。

本發明提供的對合浦珠母貝中的目的基因進行基因定位的方法，是將合浦珠母貝進行全胚原位雜交，根據全胚原位雜交的結果對目的基因進行基因定位；所述全胚原位雜交所用的探針為針對目的基因的探針。

所述全胚原位雜交可包括如下步驟：

1)將合浦珠母貝進行固定；

2)將步驟1)得到的合浦珠母貝進行重新水化、去殼和固定；

3)將步驟2)的合浦珠母貝進行預雜交；

4)將步驟3)的合浦珠母貝進行雜交；

5)將步驟4)的合浦珠母貝進行檢測。

所述步驟1)可采用如下步驟：將合浦珠母貝用4％多聚甲醛溶液4℃固定24h以上；然后依次用50％甲醇-2％多聚甲醛溶液和甲醇洗滌；

所述4％多聚甲醛溶液，溶質為多聚甲醛，溶劑為水或PBS，多聚甲醛的終濃度為4％(質量百分含量)；所述50％甲醇-2％多聚甲醛溶液，溶質為甲醇和多聚甲醛，溶劑為水，甲醇的終濃度為50％(質量百分含量)，多聚甲醛的終濃度為2％(質量百分含量)；所述PBS的制備方法如下：NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO₄?1.44g，KH₂PO₄0.24g，H₂O?1L，調pH值至7.4。

所述用50％甲醇-2％多聚甲醛溶液洗滌的時間具體可為5分鐘；所述用甲醇洗滌的時間具體可為5分鐘。

所述步驟2)可采用如下步驟：將步驟1)得到的合浦珠母貝依次用50％甲醇的PBST溶液、30％甲醇的PBST溶液水化，然后用PBST洗滌，重復一次；然后用0.2mol的EDTA處理，再置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定，最后用PBST洗兩次；

所述50％甲醇的PBST溶液，溶質為甲醇，溶劑為PBST，甲醇的終濃度為50％(質量百分含量)；所述30％甲醇的PBST溶液，溶質為甲醇，溶劑為PBST，甲醇的終濃度為30％(質量百分含量)；所述PBST制備方法如下：在PBS中加入Tween-20使其終濃度為0.1％(質量百分含量)；所述4％多聚甲醛的PBS溶液，溶質為多聚甲醛，溶劑為PBS，多聚甲醛的終濃度為4％(質量百分含量)；所述PBS制備方法如下：NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO₄?1.44g，KH₂PO₄?0.24g，H₂O?1L，調pH值至7.4。

所述步驟2)具體可采用如下步驟：將步驟1)得到的合浦珠母貝依次用50％甲醇的PBST溶液、30％甲醇的PBST溶液水化5分鐘，然后用PBST洗滌5分鐘，重復一次；然后用0.2mol/L的EDTA水溶液處理半小時，再置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，最后用PBST洗兩次，每次5分鐘。

以上任一所述方法中，所述目的基因可為nacrein基因。所述nacrein基因的序列具體可如GENBANK?ACCESS?ION?NUMBER?D83523。所述全胚原位雜交中，所用的探針具體可如序列表的序列1所示。所述合浦珠母貝具體可為附著期的合浦珠母貝。

本發明為合浦珠母貝的研究提供了基因定位的方法，為進一步研究合浦珠母貝的各種分子機制提供了很好的技術。本發明的方法易于操作，無需特殊設備，成本較低。本發明對珍珠貝的質量和珍珠的品質有重要意義。

附圖說明