[發明專利]一種5-磷酸木酮糖的制備方法

有效

• 申請號: 200910093090.2
• 申請日: 2009-09-21
• 公開（公告）號: CN101665815A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 李榮杰;徐斌;薛培儉;付松
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12P19/02
• 分類號: C12P19/02;C12R1/01;C12R1/64;C12R1/19;C12R1/725;C12R1/865
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

1.一種5-磷酸木酮糖的制備方法，其特征在于，在大腸桿菌中 過量表達帶有6個組氨酸標簽的木酮糖激酶基因，然后在樹脂層析柱 中通過組氨酸標簽與層析柱的特異性結合，對表達的木酮糖激酶進行 分離純化，同時固定化木酮糖激酶，最后加入底物木酮糖和三磷酸腺 苷，將體系加熱至70-85℃，保溫2h，合成5-磷酸木酮糖；所述的木酮 糖激酶基因來源于嗜熱厭氧乙醇菌(Thermoanaerobacter?ethanolicus)。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于其中所述木酮糖 激酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，編碼該木酮糖激酶的基因序 列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于分離純化包括步 驟：1)以NTA介質填柱，用2倍柱體積的去離子水洗滌，接著加NiSO₄溶液至NTA介質結合度達到飽和，用5倍柱體積的NAT-0緩沖液洗柱， NAT-0緩沖液為20mM?Tris-HCl?pH7.9，0.5M?NaCl；2)將含有過表 達的木酮糖激酶的大腸桿菌破碎菌體離心后得到的上清加入到 Ni²⁺-NTA樹脂柱中，反復加入2～3次后，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液 洗滌介質以去除雜蛋白，NAT-1緩沖液為含有80mmol/L咪唑的NAT-0 緩沖液。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于加入底物木酮 糖和三磷酸腺苷的體系為：D-木酮糖：重量百分比為1％，CoCl₂·6H₂O： 2×10^-4mol/L，ATP：0.5mol/L，MgSO₄·7H₂O：2×10^-3mol/L，pH?8.0。