[發明專利]一種甲烷氧化混合菌的保存方法

無效

• 申請號: 200910092358.0
• 申請日: 2009-09-07
• 公開（公告）號: CN101638632A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 邢新會;江皓;吳昊;楊程;韓冰;張翀
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/04;C12R1/26;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種甲烷氧化混合菌的保存方法。

背景技術

甲烷氧化菌是自然界中一類特殊的微生物，以甲烷為唯一碳源及能源，廣泛存在于泥土、沼澤、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。甲烷氧化菌以其獨特的性質和多樣的催化功能，在大宗化學品生產、新功能酶開發、瓦斯氣體治理以及環境污染物的生物修復方面都具有極大的應用潛力。但甲烷氧化菌純培養生長極為緩慢，功能不穩定，且甲烷氧化菌純菌資源較少。而甲烷氧化混合菌是以甲烷氧化菌為主體的不同共生菌體的組合，相比純菌更有利于工業應用。羅明芳等人研究表明，甲烷氧化混合菌具有高效降解苯酚、高效積累環氧丙烷的能力(羅明芳，等.含有甲烷氧化菌的混合菌群特性研究.微生物學報，2007，47(1)：103～109.)。

在應用混合菌時，其功能的穩定性，取決于菌群結構的穩定性。而在甲烷氧化混合菌的保存方法上，既不能使用純菌保存常用的平板傳代法，也不能采用通常的添加保水性有機物(如甘油等)的菌種冷凍保存方法，因為平板傳代過程會丟失混合菌中的大量菌種，而添加保水性有機物很容易引入其他碳源從而改變菌群結構。因此，迫切需要既簡便易行，且能有效保持甲烷氧化混合菌的菌群結構和功能的高效保存方法。

發明內容

本發明的目的就是提供一種甲烷氧化混合菌的保存方法。

本發明所提供的甲烷氧化混合菌的保存方法，包括如下步驟：將甲烷氧化混合菌加入NMS培養基中，于密封瓶中2-6℃保存；初始時，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。

所述保存方法中，初始時，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比具體可為5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

所述保存方法中，所述甲烷氧化混合菌具體可為處于對數生長期的甲烷氧化混合菌。

所述保存方法中，初始時，所述NMS培養基中所述甲烷氧化混合菌的OD₆₆₀為0.3-1.5，若OD₆₆₀小于0.3則會影響保存效果，增加活化的難度。

所述保存方法中，最好每隔10-60天重新向密封瓶中充入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。重新充入甲烷后，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比優選為5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

為保證菌種特性，可定期進行轉接活化，轉接間隔時間最好不超過一年。

需要使用甲烷氧化混合菌時，直接將保存有所述甲烷氧化混合菌的的培養瓶進行培養即可。

所述甲烷氧化混合菌的制備方法可包括如下步驟：

1)采集煤礦或垃圾填埋場的土樣；

2)將步驟1)的土樣加入NMS培養基中，于密封瓶中培養；初始時，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；每24-72小時向密封瓶中置換入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；

3)每8-12天接種步驟2)的培養液至新的NMS培養基，進行傳代；步驟2)的培養液與NMS培養基的體積比為(5-15)∶(95-85)；傳至10代以上，得到甲烷氧化混合菌。

所述步驟2)具體可為：初始時，所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為5∶(2.5-3.5)∶(15-18)；每48小時向密封瓶中置換入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養基、甲烷和空氣的體積比為5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

所述步驟3)具體可為：每10天接種步驟2)的培養液至新的NMS培養基，進行傳代；步驟2)的培養液與NMS培養基的體積比為10∶90；傳至第10代，得到甲烷氧化混合菌。