[發明專利]一種靶向冠狀病毒蛋白酶的藥物篩選模型及其應用

有效

• 申請號: 200910092315.2
• 申請日: 2009-09-10
• 公開（公告）號: CN102021145A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 陳忠斌;陳曉娟;邢雅玲;楊宇東
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12Q1/37;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及一種生物工程類檢測產品及其應用。

背景技術：

冠狀病毒是導致呼吸道感染的主要病毒之一。目前引起人類呼吸道感染的冠狀病毒已達五種，229E，OC43，SARS-CoV，NL63和HKU1。人類呼吸道感染中約30％由229E和OC43兩種冠狀病毒引起；SARS-CoV是2003年初新出現的引起人類急性呼吸道綜合癥(SARS)的一種高致病性呼吸道病原，感染死亡率約9％，是目前感染性和致病性最強的一種新發人類冠狀病毒。隨后的三年內又從呼吸道感染病人中相繼發現了兩種人類新型冠狀病毒NL63(2004年)和HKU1(2005年)。可以預測，許多不明原因的呼吸道感染可能是由其他未發現的人類新型冠狀病毒引起。

目前，臨床上還沒有治療冠狀病毒引起呼吸道感染的特異性治療藥物，針對個別冠狀病毒的疫苗研究(如SARS滅活疫苗)僅在進行中。冠狀病毒引起的呼吸道感染尤其兒童呼吸道感染是一種常年(春秋季為主)頻發性傳染病，對人類健康構成巨大威脅，嚴重影響生活質量，對醫療衛生和疾病防治工作形成巨大壓力。特異性抗冠狀病毒病毒藥物具有巨大市場應用潛力。

蛋白酶在冠狀病毒復制周期中具有重要功能，是抗冠狀病毒藥物研究的重要靶蛋白。冠狀病毒感染細胞后，基因組(+)RNA首先翻譯形成1a/1ab(1ab由1a經-1移碼翻譯形成)多聚蛋白(polyprotein)。1a蛋白含有木瓜樣蛋白酶(papain-like?protease，PLP)和3CLpro蛋白酶。1a(1ab)蛋白在PLP和3CLpro病毒蛋白酶作用下，加工裂解成16個非結構蛋白(nsp1-nsp16)。nsp1～nsp16主要定位于細胞內質網膜(ER膜)中，與ER膜相互作用形成病毒復制酶復合體(Replicase?Complex，RC)，參與病毒基因組復制和亞基因組RNA(subgenomic?RNA，sgRNA)轉錄。最后，由病毒sgRNA翻譯形成的結構蛋白(S，M，N，HE)和基因組復制形成的子代基因組RNA，組裝成新生病毒粒子，完成病毒復制周期。從冠狀病毒復制過程可以發現，病毒蛋白酶PLP和3CLpro在冠病毒復制酶復合體(RC)形成和病毒RNA復制和轉錄過程中具有重要作用，是冠狀病毒完成復制周期的關鍵蛋白，是目前最受關注的一種重要抗冠狀病毒藥物靶標。

藥物篩選模型是抗冠狀病毒藥物研究的關鍵技術之一。目前的研究現狀是，首先，在靶標選擇上主要集中在冠狀病毒的3CLpro蛋白酶。其次，藥物篩選模型主要有兩種。一是基于3CLpro蛋白酶對冠狀病毒復制酶多聚蛋白的裂解特性，建立的體外分子水平篩選模型；這種模型僅能反映病毒蛋白酶體外活性。二是病毒感染的細胞模型作為藥物篩選模型。病毒感染的細胞模型，對SARS-CoV等高致病性病毒必需使用BSL3實驗室，對實驗人員危險性大，操作不方便，且有病毒泄漏的危險。

發明內容：

本發明的目的是提供基于細胞(Cell-based?assay)的靶向冠狀病毒蛋白酶新型藥物篩選模型。冠狀病毒多聚蛋白1a(1ab)加工產物中nsp3，nsp4和nsp6含有轉膜(TM)結構域，這些轉膜結構域可介導蛋白質定位于細胞內質網(ER)膜上。本發明利用nsp3，nsp4和nsp6含有轉膜結構域和在細胞內定位等特征，使用分泌性報告基因，構建由冠狀病毒蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因組成的真核表達DNA構建體，轉染細胞后既可用于抗冠狀病毒藥物的篩選。

具體的說，本發明構建了一種靶向冠狀病毒PLP蛋白酶的藥物篩選模型：克隆冠狀病毒的PLP-TM片段到真核表達載體中，在PLP的N段帶上PLP識別的nsp2/3位點氨基酸序列-FTKLAG↓GK-，再把分泌型報告基因克隆到真核表達載體中PLP-TM片段的5’端，獲得冠狀病毒蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因組成的真核表達DNA構建體，將該DNA重組質粒轉染細胞，既可用于篩選靶向冠狀病毒PLP蛋白酶的藥物。

本發明還構建了一種靶向冠狀病毒3CLpro蛋白酶的藥物篩選模型：克隆冠狀病毒的nsp4-nsp5(3CLpro)或nsp5(3CLpro)-nsp6片段到真核表達載體中，在nsp5的N端或C端帶上3CLpro識別位點氨基酸序列-GVNLQ↓SGKVI-，再把分泌型報告基因克隆到真核表達載體中nsp4-nsp5(3CLpro)或nsp5(3CLpro)-nsp6片段的3’端或5’端，獲得冠狀病毒3CLpro蛋白酶-蛋白酶識別位點-分泌性報告基因，將該DNA重組質粒轉染細胞，既可用于篩選靶向冠狀病毒3CLpro蛋白酶的藥物。