[發(fā)明專利]從天然產(chǎn)物中篩選具有清除自由基能力的活性成分的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910091851.0
• 申請(qǐng)日: 2009-08-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101639465A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高彥祥;賀文浩;劉璇;龔英;何李
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/74;G01N30/86
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 史雙元

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物分離檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種從天然產(chǎn)物中篩選具有清除自由基能力的活性成分的方法。

背景技術(shù)

天然產(chǎn)物一般是指某一種生物所特有，或少數(shù)親緣關(guān)系相近的生物所共有的，天然來(lái)源的有機(jī)化合物。是生物通過(guò)次生代謝而產(chǎn)生的，具有特殊結(jié)構(gòu)和特殊活性的物質(zhì)。目前，天然產(chǎn)物化學(xué)成分的提取、分離和結(jié)構(gòu)測(cè)定獲得了很大發(fā)展，其中許多成分已應(yīng)用于醫(yī)藥、保健和環(huán)保等各個(gè)方面。尤其對(duì)于天然產(chǎn)物中活性成分的研究受到了很多關(guān)注，活性成分運(yùn)用于抗癌、抗感染的新藥研制得到了迅速發(fā)展。天然產(chǎn)物中活性成分一般是化學(xué)上的單體化合物，能用分子式和結(jié)構(gòu)式表示，并具有一定的理化性質(zhì)，如生物堿類、糖苷類、萜類、黃酮類、揮發(fā)油和有機(jī)酸等。一種天然物質(zhì)往往含有多種有效成分，而一種有效成分又有許多方面的活性作用，其作用機(jī)制十分復(fù)雜。

對(duì)于天然產(chǎn)物中活性成分的研究首先就是篩選其中的有效成分。篩選的傳統(tǒng)方法就是利用植物化學(xué)手段從天然產(chǎn)物中提取單一的化學(xué)成分，然后對(duì)單一物質(zhì)成分逐一進(jìn)行活性測(cè)定，從而篩選出有效成分。這是研究天然產(chǎn)物活性成分的基本手段，但是該方法存在許多的缺陷：1)天然產(chǎn)物原料需要量大。由于許多天然產(chǎn)物活性成分的含量很少，要有效的分離出活性成分用于測(cè)定或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，則原料需要量很大。然而一些天然物質(zhì)很難獲得或是瀕危物種，原料來(lái)源有限，這就限制了該方法的使用；2)提取分離過(guò)程繁瑣，耗費(fèi)大量時(shí)間和人力物力。許多分離過(guò)程常需要經(jīng)過(guò)除雜、濃縮、分離、精制、純化等多個(gè)步驟，而這些過(guò)程將耗費(fèi)許多材料，如樹(shù)脂和凝膠材料等；同時(shí)，還需要大量試劑進(jìn)行處理，分離的成本很高；3)分離步驟繁多，活性成分會(huì)出現(xiàn)一定的損失或者被破壞，不利于活性成分的篩選。

天然產(chǎn)物活性成分進(jìn)行提取后，需要進(jìn)一步的分析和檢測(cè)，這一過(guò)程主要通過(guò)色譜分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)。高效液相色譜技術(shù)(HPLC)是目前最常用的技術(shù)手段之一。高效液相色譜法借鑒了氣相色譜的理論，流動(dòng)相為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，因而具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn)。高效液相色譜能將天然產(chǎn)物的成分進(jìn)行逐一分離，但是不是所有成分均具有活性，目前仍然需要通過(guò)傳統(tǒng)分離手段獲得純物質(zhì)才能將其活性進(jìn)行測(cè)定。

自由基是含有一個(gè)不成對(duì)電子的基團(tuán)，過(guò)多的自由基存在于人體會(huì)導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損壞，從而引起許多疾病，如心臟病、腫瘤、老年癡呆癥和帕金森癥等。外界環(huán)境中不利因素如吸煙、環(huán)境污染和輻射等都會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生更多的自由基，導(dǎo)致人體衰老和病變。目前研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物中許多活性成分具有清除機(jī)體自由基的能力，尤其是其中的酚類物質(zhì)，它們能失去電子使自由基穩(wěn)定，同時(shí)本身也形成穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。國(guó)內(nèi)外很多研究都集中在篩選天然產(chǎn)物中具有清除自由基作用的活性物質(zhì)。

體外清除自由基的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然活性成分的研究，尤其是植物提取物，如中藥等。特別是穩(wěn)定自由基的運(yùn)用，如ABTS自由基(2，2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic?acid)，2，2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))和DPPH自由基(2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2，2-二苯基-1-苦肼基)，能快速簡(jiǎn)單地對(duì)提取物的活性進(jìn)行測(cè)定。然而，這些自由基測(cè)定方法存在一些不足：1)不能對(duì)提取物中單一成分進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的是總活性，單一物質(zhì)測(cè)定還需進(jìn)一步的分離純化后再測(cè)定；2)由于利用比色法進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于一些有色物質(zhì)如色素等的測(cè)定容易受到底物的干擾。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了上述缺點(diǎn)，提供了一種從天然產(chǎn)物中篩選具有清除自由基能力的活性成分的方法。本發(fā)明的方法結(jié)合了高效液相色譜的快速分離手段和自由基的測(cè)定方法，從而達(dá)到了對(duì)天然產(chǎn)物中清除自由基活性成分的快速高效的篩選，減少資源和人力的浪費(fèi)。

一種從天然產(chǎn)物中篩選具有清除自由基能力的活性成分的方法，其技術(shù)方案如下：

1)提取天然產(chǎn)物，將其過(guò)膜后經(jīng)液相色譜進(jìn)行分離，然后經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，獲得此天然產(chǎn)物的化學(xué)成分圖譜；

2)配制吸光值為0.7-0.8的自由基溶液，以0.5-0.8mL/min的流速將該自由基溶液泵入柱后反應(yīng)系統(tǒng)，控溫器內(nèi)溫度保持在30-35℃，自由基溶液進(jìn)入檢測(cè)器穩(wěn)定后將其最大吸收波長(zhǎng)處的基線進(jìn)行平衡，吸光值調(diào)為零；