[發明專利]誘導分泌表達生產重組葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法

有效

• 申請號: 200910091766.4
• 申請日: 2009-08-25
• 公開（公告）號: CN101993888A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 尹佳;周俊雄;程璇
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12P21/02;C12N1/19;G01N33/68;A61K39/00;A61P37/08;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及一種在酵母系統高密度誘導分泌表達葎草花粉主要致敏蛋白的方法，特別是一種在畢赤酵母(Pichia?pastoris，KM71H)系統高密度誘導分泌表達葎草花粉主要致敏蛋白的方法Hum?j?3的方法以及工程菌。本發明屬于基因工程藥物和醫學診斷制劑領域，該蛋白可能在葎草花粉過敏反應疾病的臨床分子診斷、變應原免疫治療、工業生產以及質控中發揮重要作用。

背景技術

薔薇亞綱大麻科一年生纏繞草本植物葎草(Humulus?japonicus或Humulus?scandens)，原產我國，廣泛分布于遠東地區，我國除新疆、青海以外的各省區均有分布，東亞各國(朝鮮、日本、俄羅斯、越南)以及歐洲、美國西海岸地區亦有分布。上世紀八十年代由北京協和醫院牽頭的第一次全國性氣傳致敏花粉調查中，在79個花粉收集點中有53個點可收集到葎草花粉，僅次于蒿屬花粉，其分布范圍基本上覆蓋全國，播散高峰為八、九月。北京協和醫院首次發現葎草花粉是我國夏秋季節僅次于蒿屬花粉的重要致敏原，是導致臨床上出現變應性鼻炎、過敏性結膜炎、花粉性皮炎、季節性哮喘等花粉癥癥狀的重要病因，很大程度上影響了患者的生活質量。

現階段對于花粉癥的診斷和治療，依賴于特異性變應原疫苗(SpecificAllergenic?Vaccines)。變應原疫苗是指包括變應原提取物以及其它成分的生物制劑，可有效用于人類過敏性疾病的診斷、預防和治療。變應原特異的免疫治療(Allergen-Specific?Immunotherapy，SIT)通過調節抗原提呈細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞的免疫應答以及調節介導變態反應效應細胞的功能和數量，從而減輕患者癥狀。WHO發布指導文件指出，SIT是唯一能影響過敏性疾病自然病程、有效阻止變應性鼻炎進展為哮喘的治療方法。

由于重組技術的廣泛運用，現階段有大量重組過敏原成功用于臨床變應性疾病免疫診斷和治療，從而避免了天然變應原成分復雜、難于質量控制、易誘發超敏反應、產量受限的缺點。

由于葎草花粉由于地理分布廣、流行病學意義重大而倍受國內外研究者重視。在國內李東棟等對武漢地區葎草花粉變應原蛋白質組分的進行了雙向電泳分析，孫秀珍等對葎草花粉變應原致敏組分進行了研究；劉昀等構建葎草和初步鑒定了花粉cDNA表達文庫，陶愛林等創建了葎草及豚草過敏原的嵌合基因，并對其抗原性作出評價等等。而在國外，韓國人Park?JW于1999首先發現了一分子量為10kDa左右的葎草變應原主要致敏蛋白，葎草過敏患者血清sIgE結合率為72％，并且測定該蛋白的N端序列為NH4+-DNXFENGMKAXTSLYDXKYQ-COO^-(X為未鑒定的未知氨基酸)，但該項研究并沒有得到該蛋白的全序列。而在GeneBank數據庫中，Jin?HS與Park?JW注冊了編號為AY335187的一段葎草致敏蛋白mRNA序列，但沒有公開發表的具體文獻說明該段序列是通過怎樣的技術路線獲得的，也沒有血清免疫學試驗證實該序列對應的蛋白為葎草主要致敏蛋白(需要葎草過敏患者血清sIgE結合率大于50％)，不過由于該序列完整，國際免疫學聯合會(IUIS)下屬的變應原命名委員會(www.allergen.org)仍然將該蛋白命名為Hum?j?1，而且作為葎草花粉變應原主要致敏蛋白。北京協和醫院變態反應科尹佳、程璇等純化了一個葎草花粉致敏蛋白，其過敏患者血清sIgE結合率約為74％，N端序列為NH4⁺MDNPFENGMKA-COO^-。該序列在分子量、等電點、過敏患者血清sIgE結合率、蛋白N端序列等方面均與1999年韓國人Park?JW發現的10kDa的主要致敏蛋白極為接近，但仍沒有獲得全序列鑒定。

發明內容

鑒于上述不足，本發明人提供一種高密度誘導分泌表達葎草花粉主要致敏蛋白的方法以及工程菌，通過對酵母系統篩選以及誘導表達、純化工序的選擇，生產了具有免疫學和生物學活性的葎草花粉主要致敏蛋白Hum?j3重組蛋白。

為達到上述目的，本發明首先利用3′-RACE技術，設計簡并引物，首次在國際上鑒定了該10kDa主要致敏蛋白對應的cDNA全序列，并依據IUIS的變應原命名規則將該蛋白命名為Hum?j?3。

本發明誘導分泌表達生產重組葎草主要致敏蛋白Hum?j?3的方法，包括如下步驟：

(1)構建表達SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列的重組表達載體；

(2)線性化重組表達載體，轉化感受態酵母細胞；

(3)篩選陽性克隆，得重組菌株，并擴大培養；