[發明專利]用于Hum j 3檢測的夾心ELISA試劑盒

無效

• 申請號: 200910090769.6
• 申請日: 2009-08-06
• 公開（公告）號: CN101988928A
• 公開（公告）日: 2011-03-23
• 發明（設計）人: 尹佳;周俊雄;程璇;孫勁旅
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

1.一種檢測葎草花粉主要致敏蛋白Hum?j3的夾心ELISA建立方法，其包括如下步驟：

1)通過純化主要致敏蛋白Hum?j3免疫BALB/c小鼠，制備多株小鼠雜交瘤單抗；

2)通過十字交叉法篩選小鼠雜交瘤的單抗，尋找最優的構建夾心ELISA方法的兩種單抗的配置：首先經過單抗與特異葎草花粉主要致敏蛋白過敏的人血清IgE的競爭ELISA法分析，確定與人血清IgE的存在最大競爭抑制率的一種候選單抗；其次通過與Hum?j3結合的單抗之間的相互競爭抑制ELISA的分析，確定構建夾心ELISA方法的另一種單抗；

3)優化夾心ELISA方法檢測葎草花粉主要致敏蛋白Hum?j3的條件，包括：包被單抗濃度、葎草變應原浸液和純化葎草花粉主要致敏蛋白的濃度稀釋范圍，酶標單抗的稀釋濃度；

4)確定夾心ELISA方法檢測葎草花粉主要致敏蛋白Hum?j3的各種方法學指標，包括：敏感性、特異性、線性范圍、顯色穩定性。

2.一種檢測葎草花粉主要致敏蛋白Hum?j3的夾心ELISA檢測試劑盒，包括捕捉抗體和檢測抗體，所述捕捉抗體包被于酶標板中，所述檢測抗體為酶標記抗體，所述捕捉抗體和檢測抗體分別特異性地針對Hum?j3的不同抗原決定簇。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述捕捉抗體是由雜交瘤細胞Hum?j3-#87-mAb保藏號CGMCC?No.3208分泌獲得。

4.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體是由雜交瘤細胞Hum?j3-#66-mAb保藏號CGMCC?No.3209分泌獲得。

5.如權利要求2～4任一項所述的試劑盒，其特征在于，其還包括以下試劑中的一種或多種：

1)洗滌液；

2)底物顯色液；

3)反應終止液；

4)Hum?j3標準品。

6.如權利要求2～4所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體的標記酶為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β-半乳糖苷酶。

7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為PBST，底物顯色液為OPD-H₂O₂顯色液、終止液為2mol/L?H₂SO₄，所述檢測抗體的標記酶為辣根過氧化物酶。

8.一種檢測葎草花粉主要主要致敏蛋白Hum?j3的方法，其利用權利要求2～7任一項所述試劑盒進行檢測，包括如下步驟：

1)向包被捕獲抗體的酶標板微孔中分別加入Hum?j3標準品和待檢測的樣品；

2)洗滌液洗板，加入檢測抗體；

3)加入底物顯色液顯色，加入反應終止液終止反應，OD492讀數；

4)以Hum?j3標準品的劑量-效應曲線為標準曲線，計算樣品Humj3含量。

9.權利要求2～7任一項所述試劑盒在檢測葎草花粉主要致敏蛋白Hum?j3含量中的應用。

10.如權利要求9所述的應用，其特征在于包括：a)在臨床實踐中用于確定皮試診斷和免疫治療時變應原浸液產品中主要致敏蛋白Hum?j3的含量以及安全有效的劑量范圍；b)在大氣生物學花粉預報、環境監測方面監測環境中微量的Hum?j3含量；c)在新藥研發中運用衡量和監測重組Hum?j3蛋白的表達質量以及產量。