[發明專利]一種表達雙基因的真核表達載體

有效

• 申請號: 200910089428.7
• 申請日: 2009-07-17
• 公開（公告）號: CN101608189A
• 公開（公告）日: 2009-12-23
• 發明（設計）人: 李奎;鞠輝明;白立景
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種表達雙基因的真核表達載體。

背景技術

在通過過表達技術研究基因功能及轉基因動物制備過程中，我們往往借助真核表達載體來實現，傳統的方法就是通過分子生物學手段將目的基因片段連接到真核啟動子下游，整合到細胞基因組中后能指導外源基因表達。該方法在基因表達及功能的研究中有著極其廣泛的應用，但該研究手段也有不足的一方面：現在的研究很多情況下可能需要研究多基因之間相互作用關系，如果通過表達單一基因的真核表達載體來研究，則需要分別構建多個載體，在細胞水平上的研究必然要多次轉染并分別篩選才能得到同時整合多個基因的細胞。同樣，在轉基因動物中要制備轉不同基因的動物時，首先必須分別制備單基因轉基因動物，并分別篩選純合子，然后純合子之間交配得到能同時表達多個基因的后代，上述方法不但研究周期長、操作繁瑣而且耗費高。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達雙基因的真核表達載體。

本發明所提供的表達雙基因的真核表達載體，其序列含有植酸酶基因表達盒和人粘病毒抗性基因1表達盒。

所述植酸酶基因表達盒是由依次串聯的CMV啟動子、植酸酶基因(appA)和BGH終止子組成；所述人粘病毒抗性基因1表達盒由依次串聯的CMV啟動子、人粘病毒抗性基因1(Mx1)和BGH終止子組成；所述植酸酶基因具有GENBANK號為AF537219的自5′端第10-1308位核苷酸序列；所述人粘病毒抗性基因1具有GENBANK號為BC032602的自5′端第292-2280位核苷酸序列；所述CMV啟動子具有GENBANK號為X03922的自5′端第541-1128位核苷酸序列；所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5′端第5596-5881位核苷酸序列。

所述表達雙基因的真核表達載體是以pcDNA3.1(+)載體為出發載體構建得到。所述表達雙基因的真核表達載體的核苷酸序列優選為序列表中序列1。

本發明通過高保真酶擴增出含啟動子、目的基因及終止子的完整真核表達調控區域，連接到另外一個真核表達載體上，構建出各自含表達調控基因的多基因真核表達載體。本發明的表達雙基因的真核表達載體的可同時高效表達植酸酶基因(appA)、人粘病毒抗性基因1(Mx1)。

本發明的表達載體在細胞水平上驗證了含雙基因的表達載體的表達效率幾乎和兩單基因組表達效率相當。本發明的含雙基因的AMP質粒轉染豬PK15細胞及制備轉基因小鼠，通過定量PCR檢測出AMP的表達雙基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基因1(Mx1))的效率幾乎和兩單基因組表達效率相當。本發明的載體顯著優勢表現在多個基因過表達時于不影響各自表達效率的前提下，實現兩個基因功能，為制備轉聯合基因動物等提供一種便捷的手段。

附圖說明

圖1：PCR擴增appA產物電泳圖；

圖2：pcDNA-appA質粒圖譜；

圖3：PCR擴增Mx1產物電泳圖；

圖4：pcDNA-Mx1質粒圖譜；

圖5：pcDNA-appA-Mx(AMP)質粒圖譜；

圖6：菌液PCR檢測AMP重組質粒；

圖7：各組細胞中appA表達水平；

圖8：各組細胞中Mx表達水平；

圖9：AMP轉基因鼠PCR檢測外源基因；

圖10：AMP轉基因鼠SOUTHERN?BLOT檢測外源基因；

圖11：半定量檢測appA及Mx的表達電泳圖

具體實施方式

下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規方法。

實施例1、表達雙基因的載體的構建

1、單基因表達載體基本構件的獲得

(1)真核表達載體pcDNA-appA的制備