[發明專利]產生抗AMP-18單克隆抗體雜交瘤、抗AMP-18單克隆抗體及其在胃癌檢測中的應用

有效

• 申請號: 200910086352.2
• 申請日: 2009-06-11
• 公開（公告）號: CN101921335A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 邢蕊;張軍;康濱;韋漢福;徐寧志;劉國振;吳琳;呂有勇;劉斯奇
• 申請（專利權）人: 北京華大蛋白質研發中心有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/577;C12N5/20
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技術領域

本發明涉及免疫化學、腫瘤生物學和細胞生物學領域。具體而言，本發明的目的在于制備一種與人體胃正常粘膜所分泌的天然胃竇粘膜分泌蛋白-AMP-18(Antrum?mucosal?protein-18)，相結合的單克隆抗體的雜交瘤；由該雜交瘤產生的抗AMP-18單克隆抗體及其相應產品可應用于人胃癌的診斷試劑或相關領域。

技術背景

胃癌是嚴重危害人群健康最常見的腫瘤之一。其發病率和致死率僅列于肺癌之后，位居癌癥死因的次位。目前，世界上治療腫瘤的主要方法是手術、放療、化療和生物治療等四種。從醫學角度看，至今腫瘤的治療沒有一種完全有效的手段，尤其是已經發生轉移的腫瘤患者，傳統的治療方法無法控制腫瘤的全身擴散。研究證實，腫瘤直徑與手術后5年生存率密切相關，腫瘤直徑＜2cm，5年生存率100％，腫瘤直徑每增加1cm，5年生存率下降20％。所以早期診斷，甚至在原位癌階段診斷對于提高癌癥治愈率極具重要意義。

隨著分子生物學的發展，腫瘤標志物得到了廣泛的重視和應用。它的出現，使人們對腫瘤的早期診斷寄予了極大的希望。腫瘤標志物(tumormarker，TM)是指在腫瘤的發生和發展過程中，由腫瘤細胞本身或者是由機體對腫瘤細胞反應而產生的與正常機體顯著不同的一類物質，它們既可能是蛋白質或核酸分子，也可以是糖類或脂類分子。腫瘤患者血液或體液中腫瘤標志物的檢測，對腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、病情監測以及預后的評價具有較高應用價值。

AMP-18是一個新近發現的由胃腺體上皮細胞合成的自分泌蛋白質，分子量約為18kDa。該蛋白專一地表達于胃粘膜，而在人體其他組織中沒有或極低表達。根據本實驗室的前期研究和其他文獻報道，我們發現AMP-18與胃癌的發生和發展有密切關系，其主要特征為，1)AMP-18的表達程度與胃粘膜上皮細胞分化正相關，即分化較低時，AMP-18的表達量很低，甚至不可檢，反之，當細胞分化程度較高時，AMP-18的表達水平接近于正常；2)AMP-18在腫瘤細胞或腫瘤組織中表達下調或缺失，而在正常組織中呈高表達；3)胃幽門螺旋桿菌感染是導致胃癌的重要原因之一，而AMP-18的表達量與患者體內的幽門螺旋桿菌量呈正相關；4)AMP-18的表達與胃癌病人的預后正相關。綜上所述，AMP-18可以作為分子標志物應用于胃癌的臨床診斷和預后療效的評估。由于AMP-18的高分泌特征，在正常的胃組織粘膜層可以檢測到它的存在；但是，在胃癌發生的區域，AMP-18隨著癌癥的進程而顯著下降，因此，一種高特異性和靈敏度的AMP-18抗體是生產臨床診斷試劑所必需的。

本發明通過原核表達該蛋白，免疫Balb/c小鼠并經過融合、克隆篩選、制備腹水、親和層析技術純化腹水獲得了鼠源單克隆抗體。免疫組化實驗檢測胃癌配對組織中的表達的實驗可見AMP-18在正常組織中高表達，但在胃癌組織中低表達或不表達。免疫印跡實驗檢測八對胃癌組織中及六種胃癌細胞系中AMP-18的表達情況的實驗顯示：在所有的八對胃癌和癌旁組織中，AMP-18在正常組織中全部高表達，在腫瘤組織中基本不表達。另外，我們僅能在正常胃黏膜細胞系GES中檢測到AMP-18的表達，而在6種胃癌細胞系中MP-18的表達均為陰性。免疫熒光定位外源AMP-18的實驗顯示：AMP-18是細胞的一個自分泌蛋白質，這就意味著AMP-18可以分泌入血，及可能在胃組織粘膜或血清中檢測到AMP-18的存在。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種能專一性針對AMP-18的單克隆抗體雜交瘤及其制備方法，以及這種抗AMP-18單克隆抗體雜交瘤分泌的抗體在腫瘤檢測中的用途；提供一種特異性好的單克隆抗體的方法，該抗體的亞類為IgG2a，能特異結合AMP-18重組抗原和天然抗原；提供一種可以用于實驗室或臨床診斷腫瘤組織AMP-18表達水平的免疫診斷試劑或檢測試劑。