[發(fā)明專利]禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910085529.7
• 申請(qǐng)日: 2009-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN101565455A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高福;孫業(yè)平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C07K7/06
• 分類號(hào): C07K7/06;C12N15/44;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/00;A61K39/145;A61K48/00;A61P31/16;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人禽流感H5N1病毒是一種來源于禽類的高致病性、高致死率的流感病毒亞型。 1997年在香港首先爆發(fā)了人禽流感的感染，18人感染，其中6人死亡。到2003年， 世界范圍內(nèi)又重新出現(xiàn)了人禽流感病例。從2003年底至今，已有408例感染，其中 205例死亡。人禽流感的傳播方式一般是從禽類傳染給人，人和人之間的直接傳染只 是偶發(fā)現(xiàn)象。但是，一旦病毒通過突變或者與人流感病毒基因發(fā)生重排，就可能產(chǎn)生 適應(yīng)在人體復(fù)制和人與人直接傳播的新毒株，導(dǎo)致流感大流行。雖然目前沒有觀察到 H5N1病毒持續(xù)的人到人的傳播，但是20世紀(jì)的3次流感大流行都起源于鳥類的流感 病毒，其中1918-1919年流感大流行奪去了四千萬人口的生命。據(jù)估計(jì)，下一次流感 大流行造成的死亡數(shù)字將遠(yuǎn)高于此。因此，為應(yīng)對(duì)流感大流行做準(zhǔn)備是十分緊迫的任 務(wù)。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)是抵御病毒入侵的重要紡線，研制高效的疫苗，激發(fā)人體的保護(hù) 性免疫反應(yīng)是防治高致病性禽流感最重要的手段。機(jī)體的免疫系統(tǒng)有體液免疫和細(xì)胞 免疫兩個(gè)分支。體液免疫是由抗體介導(dǎo)的。流感病毒通過其血凝素(HA)糖蛋白結(jié)合 細(xì)胞表面的唾液酸殘基而粘附在宿主細(xì)胞表面，再通過內(nèi)吞作用以及隨后的病毒囊膜 和宿主細(xì)胞膜的融合而進(jìn)入細(xì)胞。病毒HA對(duì)于流感病毒致病力和病毒感染的宿主范 圍起著關(guān)鍵的作用，同時(shí)HA也是體液免疫的主要靶抗原。HA特異性抗體起著阻斷病 毒粘附的作用，從而抑制病毒感染細(xì)胞。

與體液免疫不同，細(xì)胞免疫是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)所介導(dǎo)的。病毒感 染細(xì)胞后，病毒蛋白質(zhì)被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶分解成多肽，被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，再被裝載 到主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類分子上。然后多肽-MHC復(fù)合物通過高爾基體被 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，再被CTL(CD8⁺T細(xì)胞)識(shí)別。CTL識(shí)別MHC分子提呈的病毒多肽 后，分泌具有抗病毒活性的細(xì)胞因子，如IFN-γ和TNF-α，以及具有裂解細(xì)胞作用 的穿孔素，從而殺傷被病毒感染的細(xì)胞，限制病毒的復(fù)制和傳播，進(jìn)而清除病毒。這 些被CTL識(shí)別的病毒多肽就是相應(yīng)的MHC限制性的CTL表位。細(xì)胞免疫雖然可能不能 預(yù)防病毒感染細(xì)胞，但是可以通過清除被病毒感染的細(xì)胞防止流感病毒導(dǎo)致的嚴(yán)重疾 病和死亡。

目前禽流感H5N1的檢測(cè)方法包括病原學(xué)方法、血清學(xué)方法和核酸檢測(cè)方法。

通過病毒的分離鑒定是禽流感的經(jīng)典病原學(xué)方法。該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈 敏(極少量病毒也可檢出)，但操作程序繁雜、費(fèi)用高、實(shí)驗(yàn)室要求高(國(guó)家規(guī)定必 須在P3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行)、耗時(shí)費(fèi)力、周期長(zhǎng)(檢測(cè)時(shí)間需1-3周)，大面積應(yīng)用推廣受 到較大限制。

目前共有6種血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，分別是：血凝抑制試驗(yàn)(HI)、微量中和試驗(yàn)(MNT)、 免疫熒光技術(shù)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、膠體金免疫層析分析(GICA)和蛋 白免疫印跡(western?blot)。這些方法都是利用抗原抗體之間的特異性反應(yīng)，來確定 病毒亞型或者某種亞型特異性抗體的滴度。血凝抑制試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便快 速，但靈敏度較低。微量中和試驗(yàn)雖然靈敏度高，但操作繁瑣耗時(shí)。免疫熒光技術(shù)靈 敏度高，但需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備，應(yīng)用受到限制。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一般被認(rèn)為 是既簡(jiǎn)便快捷，又靈敏的方法，但是用于檢測(cè)抗體時(shí)，對(duì)抗原制備的要求較高。在這 6種檢測(cè)技術(shù)中，血凝抑制試驗(yàn)和微量中和試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法，其余4種對(duì)于常規(guī) 流感甲1和甲3亞型已有完善的方法，但是用于H5抗原的檢測(cè)還需改進(jìn)和優(yōu)化。對(duì)于膠 體金免疫層析分析，日本、美國(guó)和我國(guó)有區(qū)別甲型流感、乙型流感和H5亞型的試劑盒， 敏感度不夠高。

禽流感病毒的核酸檢測(cè)技術(shù)包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和實(shí)時(shí)定量 PCR(RTQ-PCR)。該方法不但可鑒定樣品中病毒的型及亞型，還可結(jié)合基因序列分析推 測(cè)病毒的致病力高低。其靈敏度高，較病毒分離法快速、特異性也高，是公認(rèn)的能夠 在較短時(shí)間做出準(zhǔn)確診斷的方法。但其成本較高，試驗(yàn)過程復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、儀器 設(shè)備、操作人員等要求高，同時(shí)干擾因素多，會(huì)出現(xiàn)假陰性或假陽性現(xiàn)象，診斷時(shí)不 能作為唯一的判定依據(jù)。