[發明專利]一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基等位變異的質譜方法

無效

• 申請號: 200910085251.3
• 申請日: 2009-05-27
• 公開（公告）號: CN101566599A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 晏月明;王愛麗;高利艷
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: G01N27/64
• 分類號: G01N27/64;G01N1/28;G01N1/36
• 代理公司: 北京諾孚爾知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 龐 濤

1、一種鑒定低分子量谷蛋白亞基等位變異的質譜方法，是用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對低分子量谷蛋白亞基進行鑒定，根據其蛋白特征峰，確定低分子量谷蛋白亞基的等位變異。

2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述低分子量谷蛋白亞基的制備方法包括以下步驟：

(1)用體積百分含量為30-70％乙醇溶液除去小麥中的醇溶蛋白，取沉淀；

(2)在上述步驟(1)獲得的沉淀中加入異丙醇溶液，60-70℃溫浴40-60min，取沉淀；

(3)在上述步驟(2)獲得的沉淀中加入溶液A，30-50℃溫浴50-60min；

所述溶液A由異丙醇、DTT、Tris-HCl和水組成；

所述溶液A中，異丙醇的體積百分含量為50％，DTT的體積百分含量為1％，Tris-HCl的pH為8.0，Tris-HCl終濃度為80mM；

(4)在上述步驟(3)的溶液中加入溶液B，50-60℃溫浴30-40min，取上清；

所述溶液B由異丙醇、4-乙烯基吡啶、Tris-HCl和水組成；

所述溶液B中，異丙醇的體積百分含量為50％，4-VP的體積百分含量為1.4％，Tris-HCl的pH為8.0，Tris-HCl的終濃度為80mM；

(5)在上述步驟(4)獲得的上清中加入丙酮溶液，取沉淀，得到小麥低分子量谷蛋白亞基。

3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，所述乙醇溶液為體積百分含量為70％的乙醇水溶液。

4、根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，所述異丙醇溶液為體積百分含量為55％的異丙醇水溶液。

5、根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(5)中，所述丙酮溶液為體積百分含量為80％的丙酮水溶液。

6、根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，溫浴的條件為65℃溫浴50min；所述步驟(3)中，溫浴的條件為40℃溫浴55min；所述步驟(4)中，溫浴的條件為55℃溫浴35min。

7、根據權利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：所述低分子量谷蛋白亞基上樣前還進行預處理；

所述預處理是將低分子量谷蛋白亞基溶于溶液C中；

所述溶液C由乙腈、TFA和水組成；

所述溶液C中，乙腈的體積百分含量為50％，TFA的體積百分含量為0.05％。

8、根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述低分子量谷蛋白亞基的上樣包括以下步驟：

將芥子酸溶液滴加到靶板的樣品孔內，待芥子酸溶液干燥后，在樣品孔內再滴加預處理過的低分子量谷蛋白亞基溶液，待低分子量谷蛋白亞基溶液干燥后，再在樣品孔內滴加芥子酸溶液；

所述芥子酸溶液是將芥子酸溶解于溶液C中得到的；

所述溶液C由乙腈、TFA和水組成；

所述溶液C中，乙腈的體積百分含量為50％，TFA的體積百分含量為0.05％；

所述芥子酸溶液中，芥子酸的濃度為10mg/ml。

9、根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀的參數設置如下：

(1)加速電壓：25kV；

(2)導絲電壓：0.15％；

(3)電網電壓：94％；

(4)延遲時間：950ns；

(5)激光功率：1900-2400(step?100)；

(6)分子量范圍：10-50kDa；

(7)Low?mass?gate：10kDa；

(8)Digitizer?Binsize：4nsec；

(9)輸入帶寬：250MHz；

(10)50laser?shots/Mass?spectra，自動積累隨機模式。

10、根據權利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述低分子量谷蛋白亞基等位變異的位點為低分子量谷蛋白亞基的Glu-3位點。