[發明專利]表征遺傳毒性的重組菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 200910083281.0
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101538549A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 李廣賀;黃巍;宋一之
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12Q1/02;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢

技術領域

本發明涉及表征遺傳毒性的重組菌及其構建方法與應用。?

背景技術

隨著近代工業的發展，環境污染日趨嚴重，人類向環境中排放大量的有毒有害 物質，危害人類健康，因此對有毒物質的檢測至關重要。其中，對遺傳毒物的重視 和遺傳毒性的檢測，是近十年來備受關注的領域。通常對遺傳毒物的檢測有兩種手 段——物理化學方法和生物方法。理化方法基于對樣品成分的儀器分析，如GC-MS 或HPLC。通過理化手段可以獲得樣品的成分數據，經過毒性數據換算從而得到樣品 中該物質的毒性。但理化分析方法程序多，成本高，不適于現場快速和高通量的應 用，而且所得到毒性數據未考慮該物質在環境中的生物有效性，更重要的是，結果 忽略了毒性物質間的拮抗、加合和協同作用(Sorensen，S.J.，M.Burmolle，and L.H.Hansen，Making?bio-sense?of?toxicity：new?developments?in?whole-cell biosensors.Current?Opinion?in?Biotechnology，2006.17(1)：p.11-16)。 因此，生物手段在遺傳毒性檢測中具有重要的意義。其中生物傳感細胞是其中發展 較快的一類檢測方法。

遺傳毒性檢測的生物傳感細胞是一類基因工程菌，其DNA包含啟動基因和報道 基因兩個關鍵片段。報道基因不具有啟動子。啟動基因只在造成DNA損傷的毒性物 質存在下被誘導表達，使得其下游的報道基因表達產生可被測量的產物，并隨啟動 子表達強度升高而信號增強。

在對大腸桿菌DNA損傷修復研究中，研究者發現了在損傷因素誘導下發生的 SOS修復系統(孟紫強，環境毒理學.第一版.2000，北京：中國環境科學出版社.)。 SOS系統由recA和lexA兩個基因調控。LexA蛋白質在SOS系統中阻遏lexA、recA， umuDC、uvrA、uvrB、uvrC等基因的表達，當細胞暴露于遺傳毒物時，RecA蛋白質 被活化為蛋白酶，與阻遏蛋白LexA結合，使后者裂解。一旦LexA蛋白被裂解，所 有參與SOS反應的基因都將充分表達，使細胞的修復得以發生。基于SOS系統，研 究者通過分子生物學手段，構建了多種被SOS系統的啟動子誘導表達的全細胞生物 傳感器。

目前成熟的檢測遺傳毒性的生物傳感器方法有umu/SOS顯色實驗法，SOS chromotest，Mutatox等，這些方法多已進行商業生產。其中umu方法和SOS chromotest方法有相應的ISO標準規范其使用方法。umu顯色實驗通過SOS系統的 umuCD操縱子啟動lacZ基因，SOS?chromotest通過SOS過程中的sulA基因啟動lacZ 基因，從而實現通過監測報道基因的報道產物來檢測遺傳毒物的目的。SOS系統給 出的檢測結果與傳統的檢測致突變的Ames實驗結果相關性很高，在數百種受試物 中，SOS?chromotest與Ames實驗給出82％的相似結果(Quillardet，P.and?M. Hofnung，The?SOS?chromotest：a?review.Mutat?Res，1993.297(3)：p.235-79.)。 但umu與SOS方法的時間和成本上遠優于Ames實驗，已在大氣、水體和土壤遺傳 毒性檢測中廣泛應用(潘峰，王萬峰，時蕾，Umu測試法及其在環境科學中的應用. 安徽農業科學，2007.35(8)：p.2208-2210.)。

雖然以發光基因為報道基因的遺傳毒性檢測的基因工程菌在文獻中有所報道， 但由于構建手段的局限，宿主菌均采用大腸桿菌或鼠傷寒沙門菌。同時，實現生物 傳感的關鍵基因——啟動基因和報道基因，都位于質粒載體中，以質粒的形式復制。 因此需要特殊的培養條件，維持質粒。而且質粒的拷貝數不固定，會造成生物傳感 細胞表達不穩定。

發明內容

本發明的目的是提供一種表征遺傳毒性的重組菌及其構建方法與應用。

本發明所提供的表征遺傳毒性的重組菌，命名為Acinetobacter?sp. ADP_recA_km_lux是染色體的recA基因中含有報道基因的不動桿菌 (Acinetobacter?sp.)ADP1；所述報道基因與recA基因具有共同的啟動子。

所述報道基因與recA基因具有共同的啟動子，其轉錄受recA基因啟動子調控， recA基因的表達使得報道基因表達。