[發明專利]一種雙特異抗腫瘤重組腺病毒及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 200910082428.4
• 申請日: 2009-04-16
• 公開（公告）號: CN101864452A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 金寧一;李霄;李昌;魯會軍;田明堯;金擴世;陳漉;劉妍;高鵬;楊恩成
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K48/00;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張慶敏

技術領域

本發明屬于生物技術和基因領域，具體涉及一種雙特異抗腫瘤重組腺病毒及其構建方法和應用。

背景技術

惡性腫瘤的發展是多因素參與的動態過程，若未及時發現并采取有效控制措施，其強大繁殖能力所導致的驚人蔓延速度將成為所有療法必然面對的挑戰。此時，如何有效清除惡性腫瘤是患者生命的最后防線。

多年來對腫瘤基因治療研究的經驗表明，怎樣在與惡性腫瘤的競速中取得完勝是實現絕地反擊的關鍵。因此，可以得出惡性腫瘤無堅不摧，但唯快不破的結論，即無論惡性腫瘤如何肆虐，只要實現快速抑瘤，從而使抑瘤過程在惡性腫瘤發展的動態平衡中占得上風，就能達成治療惡性腫瘤的目的。

當然，上述唯快不破的結論是以安全性為基礎的。無疑，手術治療、化療和放療是目前腫瘤治療的首選方式，而上述療法對機體的不可逆創傷和對生理的次生影響卻如飲鴆止渴，令所有人談之色變。目前，腫瘤基因治療研究應摒棄拆東補西的傳統方案，通過將特異性作為研究重點來夯實候選藥物的安全性基礎。

多數化療藥物和射線通過p53發揮作用，而各類腫瘤中50％～60％存在p53突變，從而嚴重影響治療效果。另外，bcl-2可抑制細胞凋亡，從而成為一些腫瘤化療耐藥的物質基礎。因此，如何在抗腫瘤候選藥物研究伊始即著眼解決耐藥問題，也是抗腫瘤藥物研發成功與否的關鍵之一。

惡性腫瘤超過100種，幾乎可以發生在身體任何部位。全世界70％的惡性腫瘤死亡病例發生在中低收入國家，發達國家以不計成本的方式治療只能將個別惡性腫瘤類型的5年平均生存率提高至50％～60％。雖然宮頸癌、乳腺癌和結腸癌等惡性腫瘤，若發現及時，輔以適當療法，可以得到有效治療。但在欠發達國家，由于公共衛生水平、醫療質量和診治費用等諸多限制，這些極易控制的惡性腫瘤也難以得到有效治療，這已使中國成為名副其實的“癌癥大國”。研發高效、安全、廉價的抗腫瘤新藥是惠國利民之舉，已成當務之急。

總之，對于惡性腫瘤，人們需要更迅速、更特異、更安全、更溫和、更廣譜、更經濟和無耐藥之憂的治療方式，這種渴望催生了全世界科研工作者數十年的孜孜以求。

研究表明，hTERTp(人端粒酶逆轉錄酶啟動子)在腫瘤細胞系中明顯激活，除了干細胞、生殖細胞、活化的淋巴細胞外，hTERTp的活性幾乎僅限于腫瘤細胞。如此，hTERTp可實現目的基因表達的腫瘤特異性?；诖藰嫿╤TERTp調控的自殺基因、藥物前體激活基因和抑瘤基因的各類腫瘤生物治療制劑，具有對腫瘤高特異和對正常細胞低毒的優勢，已成為腫瘤特異性基因治療的研究熱點。

研究發現，Apoptin能夠在不影響正常細胞的前提下，在8～12小時內特異性地誘導肝癌、淋巴瘤、血液系統腫瘤、乳腺癌、肺癌細胞和鱗狀細胞癌等多種腫瘤細胞發生凋亡。另外，無論腫瘤細胞的p53基因是否存在突變，Apoptin均可有效誘導腫瘤細胞凋亡。并且，bcl-2的過表達不僅對Apoptin的凋亡誘導作用無影響，反而能增強Apoptin的凋亡誘導功能。值得說明的是，bcl-2對Apoptin所誘導凋亡的促進作用不是這兩者直接作用的結果，因為正常細胞即使過表達bcl-2，Apoptin也不會對其產生影響。Apoptin的應用將大大降低產生耐藥性的可能。

傳統重組腺病毒污染RCA往往發生在穿梭載體與基因組骨架在含E1基因的293細胞內重組過程中。有時RCA污染比例很高，不得不經過額外的、耗時的蝕斑純化過程以純化重組腺病毒。研究發現，腺病毒基因組骨架若缺失包裝必需信號，可有效降低RCA污染的可能性，從而避免蝕斑純化過程。

發明內容

本發明目的在于針對現有抗腫瘤藥物的缺陷，提供一種新型雙特異抗腫瘤重組腺病毒，用于腫瘤的治療和預防。

本發明另一目的在于提供上述重組腺病毒的構建方法。

本發明的再一目的在于提供雙特異抗腫瘤重組腺病毒在制備預防和治療腫瘤藥物方面的應用。

本發明抗腫瘤重組腺病毒，其包括腺病毒載體和引入其中的表達盒，所述腺病毒載體的復制必須基因突變，所述表達盒包括由腫瘤特異性啟動子與E1a基因組成的表達盒和由真核啟動子與Apoptin基因組成的表達盒。

所述腺病毒載體的基因組左側ITR和包裝信號區缺失。

所述腫瘤特異性啟動子為hTERTp(人端粒酶逆轉錄酶核心啟動子)或PEG-3p啟動子等。

所述真核啟動子為任意一種真核啟動子，比如CMV啟動子(人類巨細胞病毒啟動子)，當然也可以采用腫瘤特異性啟動子。

所述腺病毒載體源自為人5型腺病毒。