[發(fā)明專利]抗阿爾茨海默病單克隆抗體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910082077.7
• 申請日: 2009-04-22
• 公開（公告）號: CN101531717A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發(fā)明（設計）人: 何金生;張瑩;王鑫;洪濤
• 申請（專利權）人: 北京交通大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/577;A61K39/395;A61P25/28
• 代理公司: 北京市商泰律師事務所
• 代理人: 毛燕生

技術領域：

本發(fā)明涉及一種新型抗阿爾茨海默病單克隆抗體。本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體在制 備阿爾茨海默病的診斷試劑和治療藥物中的應用。

背景技術：

阿爾茨海默病(Alzheimer’s?disease，以下簡稱AD)是全世界60歲以上老年人癡呆 的最主要原因。AD的早期診斷、預防和治療具有重大意義。自1975年Kohler和Milstein 創(chuàng)建B淋巴細胞雜交瘤技術以來，各種單克隆抗體相繼出現，用于疾病診斷治療的基礎與 臨床研究，發(fā)揮了重大作用。

已知Aβ寡聚體是引起AD早期病理和學習記憶行為改變的主要原因。1999年Schenk 等用Aβ42分子為多肽疫苗免疫PDAPP轉基因小鼠，經過治療，幼年小鼠腦內沒有產生β- 淀粉樣斑塊沉積、神經細胞萎縮等AD的典型病變。已經發(fā)病的老齡鼠，治療后病變明顯 減輕。2001年人工合成的Aβ1-42疫苗(AN1792)進行了臨床IIa期實驗。不幸的是在接 受治療的患者中有6％出現了腦膜炎。由于治療可能存在的副作用，該療法在2002年的1 月被全面停止。臨床結果顯示，在接受治療一年后，體內產生針對Aβ斑塊抗體的患者與 沒有產生抗體的患者相比，認知能力下降速度減慢。患者的尸檢結果顯示在大腦皮層中沒 有或只有少量的Aβ斑塊，在斑塊消失部位發(fā)現反應性小膠質細胞，同時發(fā)現有IgG結合 到斑塊上。

從此以后，眾多學者開始采用針對Aβ分子的免疫療法來治療或預防AD，取得了不同 程度的療效。但現有技術的免疫方式及效果仍不夠理想，尤其是不能特異性識別特定的Aβ 寡聚體。在免疫治療實驗中，有可能與纖維結合，發(fā)生腦出血等副反應。

因此，研制特異性識別和結合Aβ寡聚體的單克隆抗體，確有必要。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的目的是提供一種抗阿爾茨海默病單克隆抗體，直接目的是提供抗人Aβ單克 隆抗體，能夠特異性識別和結合Aβ寡聚體，可用于制備阿爾茨海默病的診斷試劑和治療 藥物。本發(fā)明制備了寡聚體高親和性抗人Aβ單克隆抗體，取名為A8。

本發(fā)明人使用5’RACE的方法克隆到Aβ寡聚體高親和性單抗A8輕鏈、重鏈可變區(qū) 基因。根據抗體恒定區(qū)CH-1區(qū)的最保守的一段序列設計引物，進行反轉錄，在cDNA產 物的5’端加上Poly(C)尾巴，然后使用針對多聚脫氧核苷酸尾巴設計的錨定引物與基因特 異性引物通過PCR方法將目的基因擴增出來。序列分析表明，A8抗體輕鏈和重鏈可變區(qū) 序列與已經提交的小鼠IgG可變區(qū)序列同源性達90％與92％。可以確定所得到的序列為 抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可編碼正確的小 鼠抗體可變區(qū)。

A8重鏈和輕鏈可變區(qū)基因是從能夠分泌較高活性的鼠源性寡聚體高親和性抗Aβ單抗 的雜交瘤細胞株中克隆的。其中所述的重鏈可變區(qū)基因全長為450bp，所述的輕鏈可變區(qū) 基因全長為429bp，兩個基因重組后可用于表達特異性識別和結合Aβ寡聚體的抗體活性 片段。

抗Aβ寡聚體單抗A8輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆。

分泌產生上述抗阿爾茨海默病單克隆抗體的細胞株為北京交通大學生命科學與生物 工程研究院采用傳統(tǒng)的骨髓瘤與脾細胞融合的方法獲得的一株Aβ寡聚體高親和性的鼠源 性抗人Aβ單抗雜交瘤細胞株，命名為A8，其抗原為Aβ1-42聚集物，其分泌的抗體分子 亞型為IgG3。

所述A8雜交瘤細胞已經在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏。

所述抗人Aβ單克隆抗體A8的重鏈與輕鏈可變區(qū)如SEQ?ID?NO：1～SEQ?ID?NO：4所 示。其中：

SEQ?ID?NO：1是抗人Aβ單克隆抗體重鏈可變區(qū)DNA序列；

SEQ?ID?NO：2是抗人Aβ單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列。

SEQ?ID?NO：3是抗人Aβ單克隆抗體輕鏈可變區(qū)DNA序列；

SEQ?ID?NO：4是抗人Aβ單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。

本發(fā)明在制備抗人Aβ單克隆抗體及其性質和功能鑒定中進行了如下實驗：

1、抗原制備及抗體性質的鑒定

Aβ寡聚混合物(即本發(fā)明所用的免疫抗原)的制備(見實施例1，“1.Aβ寡聚混合物 的制備”)。其亞類為IgG₃，抗原識別表位在Aβ多肽N端1-6位氨基酸。